組蛋白去乙酰化酶調(diào)控MKK7表達(dá)及膠質(zhì)瘤侵襲的機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　1、探討膠質(zhì)瘤細(xì)胞中是MKK7還是MKK4調(diào)控JNK-c-Jun活性；
　　2、探討HDAC在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中是否調(diào)控MKK7或MKK4的表達(dá)；
　　3、探討是哪個(gè)或者哪些HDAC成員調(diào)控MKK7或MKK4的表達(dá)；
　　4、探討HDAC調(diào)控MKK7或MKK4的具體機(jī)制是什么；
　　5、探討干預(yù)HDAC或JNK-c-Jun活性是否影響膠質(zhì)瘤遷移、侵襲；
　　6、探討人腦膠質(zhì)瘤組織中HDAC與

2、MKK7或MKK4表達(dá)是否存在相關(guān)性。
　　研究方法：
　　1.在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中使用小分子干擾沉默MKK7或MKK4，Western blot檢測(cè)p-JNK/JNK,以及p-c-Jun/c-Jun的表達(dá)。
　　2.用組蛋白去乙?；敢种苿?Histone deacetylases inhibitor HDACI)：TSA、SAHA、M344、VPA處理多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞后檢測(cè)MKK7，p-JNK/JNK,以及p-c-Jun/

3、c-Jun的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)MKK7 mRNA表達(dá)。
　　3.用小分子干擾HDAC、特異性HDACI、過(guò)表達(dá)HDAC等方法處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞，檢測(cè)MKK7及p-JNK/JNK,p-c-Jun/c-Jun的表達(dá)及MKK7mRNA的表達(dá)。報(bào)道基因技術(shù)檢測(cè)MKK7熒光素表達(dá)。
　　4.（a）免疫細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞漿與核分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HDAC在細(xì)胞核與細(xì)胞漿的分布情況；
　　（b）染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immuno

4、precipitation，CHIP）檢測(cè)HDAC是否在 MKK7啟動(dòng)子上；
　　（c）利用報(bào)道基因技術(shù)檢測(cè)截短或突變MKK7啟動(dòng)子后對(duì)其活性的影響并尋找調(diào)控MKK7表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子；
　?。╠）小分子干擾、過(guò)表達(dá)該轉(zhuǎn)錄因子，檢測(cè)對(duì)MKK7表達(dá)的影響，抑制HDAC情況下沉默該轉(zhuǎn)錄因子，檢測(cè) MKK7蛋白及 mRNA表達(dá)。
　?。╡）用抑制蛋白合成的抑制劑亞胺環(huán)己酮（cycloheximide，CHX)及抑制蛋白降解的抑制

5、劑MG132(Proteasome抑制劑)等處理，檢測(cè)其對(duì)MKK7蛋白的影響。
　　5、小分子干擾、過(guò)表達(dá)MKK7、HDAC以及特異性HDACI處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這些處理對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。
　　6、免疫組化檢測(cè)HDAC及MKK7在人腦膠質(zhì)瘤樣本中的表達(dá)及其相關(guān)性。
　　研究結(jié)果：
　　1.在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中是MKK7而不是MKK4調(diào)控JNK-c-Jun活性
　　在膠質(zhì)瘤U

6、251、U87細(xì)胞中沉默MKK7或MKK4，Western blot顯示沉默MKK7后JNK-c-Jun活性下調(diào)。而沉默MKK4后JNK-c-Jun活性無(wú)明顯變化。
　　2.抑制HDAC抑制MKK7的表達(dá)從而抑制JNK-c-Jun活性
　　分別用HDACI：TSA、SAHA、M344、VPA處理U251、U87、T98G三種膠質(zhì)瘤細(xì)胞，均抑制MKK7，p-JNK,以及p-c-Jun表達(dá)均下調(diào)，但JNK、c-Jun的表達(dá)未發(fā)生

7、改變。PCR顯示MKK7 mRNA表達(dá)下調(diào)。
　　3.HDAC4轉(zhuǎn)錄調(diào)控MKK7
　　在膠質(zhì)瘤U251中沉默HDAC,Western blot顯示在沉默HDAC4或HDAC6時(shí)MKK7均下調(diào)，RT-PCR顯示沉默HDAC4后MKK7mRNA下調(diào)，進(jìn)一步使用HDAC4特異性HDACI:LMK235、Tasquinimod處理U251、U87、T98G后，Western blot顯示MKK7及p-JNK,p-c-Jun下調(diào)，JN

8、K，c-Jun無(wú)明顯變化，RT-PCR顯示MKK7mRNA下調(diào)，過(guò)表達(dá)HDAC4，MKK7及p-JNK,p-c-Jun上調(diào)，JNK，c-Jun無(wú)明顯變化。RT-PCR提示MKK7mRNA上調(diào)。
　　4、轉(zhuǎn)錄因子SP1介導(dǎo)了在HDAC4滅活情況下MKK7的負(fù)調(diào)控
　?。╝）將MKK7啟動(dòng)子全長(zhǎng)逐步截短，當(dāng)截短到-149bp時(shí)MKK7的熒光素表達(dá)明顯升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而截短至-258bp時(shí)熒光素表達(dá)并沒有改

9、變，突變這一段中SP1結(jié)合位點(diǎn)，MKK7熒光素表達(dá)亦明顯升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。╞）干預(yù)HDAC4的情況下檢測(cè)MKK7熒光素表達(dá)，結(jié)果與MKK7蛋白、mRNA改變是一致的。
　?。╟）免疫熒光、細(xì)胞漿與細(xì)胞核分離實(shí)驗(yàn)證明HDAC4在膠質(zhì)瘤細(xì)胞核中有表達(dá)，
　?。╠）CHIP實(shí)驗(yàn)證明HDAC4在MKK7的啟動(dòng)子上。
　?。╡）在U251、U87細(xì)胞中沉默SP1,Western blot顯示M

10、KK7上調(diào)，而過(guò)表達(dá)SP1，MKK7下調(diào)。在使用HDAC4抑制劑LMK235抑制HDAC4情況下沉默SP1，MKK7蛋白和mRNA均上調(diào)。
　　5、HDAC6介導(dǎo)了MKK7的穩(wěn)定性
　　在U251、U87細(xì)胞中沉默HDAC6，Western blot顯示MKK7及p-JNK,p-c-Jun的表達(dá)下調(diào)，JNK、c-Jun表達(dá)沒有變化。但MKK7 mRNA卻無(wú)明顯變化。HDAC6特異性抑制劑Tubacin、CAY10603、AC

11、Y1215處理U251、U87、T98G細(xì)胞，MKK7及p-JNK,p-c-Jun的表達(dá)下調(diào)，JNK、c-Jun表達(dá)沒有變化。而RT-PCR顯示MKK7 mRNA無(wú)明顯變化。過(guò)表達(dá)HDAC6后MKK7及p-JNK,p-c-Jun的表達(dá)上調(diào)，但MKK7mRNA表達(dá)亦無(wú)明顯改變。CHX時(shí)間點(diǎn)處理U251、U87細(xì)胞，MKK7在2h就減少了一半，隨著時(shí)間延長(zhǎng)MKK7減少的越來(lái)越多。抑制HDAC6情況下MG132處理U251細(xì)胞，MKK7的減少

12、受到抑制。
　　6、沉默MKK7抑制膠質(zhì)細(xì)胞遷移、侵襲，抑制HDAC4/HDAC6，抑制膠質(zhì)細(xì)胞遷移、侵襲
　　轉(zhuǎn)染siMKK7、siHDAC4、siHDAC6，用HDAC4抑制劑LMK235、Tasquinimod，HDAC6特異性抑制劑Tubacin、CAY10603處理U251細(xì)胞，Transwell實(shí)驗(yàn)顯示
　　膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力明顯下降，而過(guò)表達(dá)MKK7、HDAC4、HDAC6，膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲能力

13、明顯增強(qiáng)。
　　7、人腦高級(jí)別膠質(zhì)瘤樣本中HDAC4/HDAC6與MKK7表達(dá)呈正相關(guān)
　　收集20例高級(jí)別膠質(zhì)瘤樣本，免疫組化檢測(cè)HDAC4/HDAC6與MKK7的表達(dá)，Pearson相關(guān)分析HDAC4與MKK7，HDAC6與MKK7的相關(guān)性。人腦高級(jí)別膠質(zhì)瘤樣本中HDAC4/HDAC6與MKK7表達(dá)呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中是MKK7而不是MKK4調(diào)控JNK-c-Jun活性；
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