大鼠體外循環(huán)后肝細(xì)胞損害及生長(zhǎng)激素上調(diào)STAT5信號(hào)通路的保護(hù)作用和機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：體外循環(huán)(CPB)對(duì)機(jī)體是一種全身性的強(qiáng)刺激，能引起機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。應(yīng)激引起的過度的炎癥反應(yīng)造成組織損害、多器官功能障礙綜合征(MODS)，是心臟外科患者術(shù)后死亡的主要原因之一。因此，CPB過程中器官保護(hù)一直是心血管外科臨床與基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)。一直以來，人們對(duì)CPB所致的心、腦、肺、腎等器官的研究較多，也比較深入，而對(duì)肝臟功能的影響及其機(jī)制卻缺乏深入系統(tǒng)研究。我們知道，肝臟是應(yīng)激反應(yīng)的中心器官和重要靶器官之一。臨床研究表明，

2、CPB術(shù)后不僅存在較高比例肝酶譜升高，而且存在著混合性的高膽紅素血癥(23.2-35.1％)，肝功能障礙，甚至肝功能衰竭。惡性肝損害一旦發(fā)生，治療棘手，往往導(dǎo)致MODS，預(yù)后差，病死率高。而慢性肝病或肝硬變患者CPB術(shù)后死亡率更高達(dá)25-31％，并發(fā)癥發(fā)生率更高達(dá)58-66％。因此肝功能障礙是CPB術(shù)后的嚴(yán)重并發(fā)癥。我國是個(gè)肝炎大國，很多心臟病病人本身就是肝炎或肝病患者，而心臟病本身也可以導(dǎo)致急性或慢性肝損害，此類患者心臟手術(shù)的時(shí)機(jī)選擇

3、以及適應(yīng)癥也是困繞心外科醫(yī)生的問題，有的患者因此而喪失治療的機(jī)會(huì)。因此研究CPB過程中肝細(xì)胞損傷的發(fā)生機(jī)制及探討相應(yīng)的保護(hù)措施，對(duì)增強(qiáng)手術(shù)耐受性，促進(jìn)術(shù)后肝功能恢復(fù)具有重要意義。 臨床研究表明，CPB術(shù)后高膽紅素血癥或黃疸是由結(jié)合和非結(jié)合膽紅素共同升高所致。這說明并非單純由于溶血導(dǎo)致，同時(shí)也存在著肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)膽紅素的功能障礙。而膽紅素的轉(zhuǎn)運(yùn)則完全依賴于位于肝細(xì)胞膜面的肝膽膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMTs)，也稱膽紅素轉(zhuǎn)運(yùn)子。HMTS基因表達(dá)異

4、常有可能導(dǎo)致肝細(xì)胞膽汁淤積和肝細(xì)胞受損，而這類基因表達(dá)的信號(hào)調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。而CPB時(shí)存在膽紅素代謝異常，其分子機(jī)制尚未明確，我們推測(cè)可能與HMTs基因表達(dá)的改變有關(guān)，此類研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。 綜合文獻(xiàn)報(bào)道，在大多數(shù)HMTS啟動(dòng)子區(qū)域含有類干擾素活化序列，相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子與該序列結(jié)合后可啟動(dòng)}tMTs的轉(zhuǎn)錄。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化因子5(STAT5)是胞漿信號(hào)蛋白，活化后可直接轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的類干擾素

5、活化序列結(jié)合，引起靶基因的活化。因此我們推測(cè)STAT5途徑可能是調(diào)控HMTs基因表達(dá)的途徑之一。 STAT5信號(hào)途徑具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，可促進(jìn)合成代謝、刺激細(xì)胞再生、抗凋亡、調(diào)節(jié)急性期反應(yīng)、穩(wěn)定腸粘膜屏障等功能。已知生長(zhǎng)激素(GH)-生長(zhǎng)激素受體(GHR)軸是引起STAT5活化的最主要的路徑。GHR主要位于肝細(xì)胞，當(dāng)GH分泌不足和GHR表達(dá)下降時(shí)，STXT5的活性亦隨之降低。因此給予外源性GH上調(diào)STAT5活性調(diào)控HMTS表達(dá)

6、具有理論上的可行性。本研究可豐富對(duì)肝細(xì)胞膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)調(diào)控的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。 由于CPB是一個(gè)可以預(yù)期的應(yīng)激反應(yīng)，我們完全可以提前采取措施，在非應(yīng)激條件下建立機(jī)體對(duì)圍手術(shù)期損傷機(jī)制的耐受性，激發(fā)機(jī)體的自然防御機(jī)制減輕炎癥反應(yīng)和器官損傷，是很有前景的途徑。但是通過GH預(yù)處理保護(hù)CPB后肝細(xì)胞功能的作用及機(jī)制研究未見報(bào)道。深入探討這一途徑的效果和可行性對(duì)于改善CPB后全身炎癥反應(yīng)，減少并發(fā)癥具有重要臨床意義。 方法：

7、1．利用顯微外科器械，采用微型化CPB環(huán)路設(shè)備，經(jīng)右頸靜脈腔房引流、左頸動(dòng)脈灌注方法建立大鼠閉胸式CPB 2h模型，對(duì)CPB的大鼠進(jìn)行分組，常規(guī)CPB組和GH干預(yù)CPB組(簡(jiǎn)稱GH組，術(shù)前3天開始肌注GH 2.5mg/kg，1/日，預(yù)充液中加入2.5mg/kg)，同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組(SH組)和正常對(duì)照組(N組)。 2．觀察CPB后肝細(xì)胞損害與全身炎癥反應(yīng)的關(guān)系：檢測(cè)指標(biāo)包括一般肝功能檢測(cè)；血清肝臟結(jié)構(gòu)蛋白：前白蛋白(PA)、轉(zhuǎn)鐵蛋

8、白(Tf)；血清急性期反應(yīng)蛋白：C反應(yīng)蛋白(CRP)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)；血清致炎因子：TNF-α、IL-1β、IL-6等的測(cè)定；血清GH、GH結(jié)合蛋白(GHBP)改變；肝臟改變的研究(肝細(xì)胞凋亡、再生情況及病理組織學(xué)改變等)。 3．觀察CPB后肝細(xì)胞膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能的改變：利用免疫熒光組化、RT-PCR、Westemblot等方法從細(xì)胞和分子水平測(cè)定肝細(xì)胞HMTs (NTCP，BSEP、FXR)的表達(dá)情況； 4．觀

9、察CPB對(duì)肝細(xì)胞STAT5活性的影響及GH-GHR途徑上調(diào)STAT5調(diào)控HMTs的機(jī)制：利用免疫熒光組化、原位雜交、RT-PCR、Western blot等方法從細(xì)胞和分子水平測(cè)定肝細(xì)胞GHR、STAT5的表達(dá)情況；觀察STAT5活性改變對(duì)肝細(xì)胞HMTs的表達(dá)及功能的影響。 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.0軟件行，檢驗(yàn)及ANOVA。 結(jié)果： 1．通過微型化CPB環(huán)路設(shè)備

10、，經(jīng)右頸靜脈腔房引流、左頸動(dòng)脈灌注方法成功建立建立大鼠CPB模型，轉(zhuǎn)流過程中血流動(dòng)力學(xué)、血?dú)夥治龅戎笜?biāo)均在正常范圍，術(shù)后可以長(zhǎng)期生存。 2．CPB后早期存在著明顯的肝細(xì)胞損害，以CPB后3h最為明顯；表現(xiàn)為肝功能受損，ALT、TB增高；血清肝臟結(jié)構(gòu)蛋白濃度降低；血清急性期反應(yīng)蛋白濃度增加，肝細(xì)胞凋亡增加，炎性細(xì)胞浸潤。血清GI-tBP降低，血清致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6升高。直線回歸分析表明肝損害與炎癥反應(yīng)及GHB

11、P水平高度相關(guān)。 3．大鼠CPB后存在肝細(xì)胞膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙，肝膽膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HMTs對(duì)CPB高度敏感，以CPB后3h最為明顯；表現(xiàn)為CPB早期各種HMTs的mRNA及蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)不同程度的下降和不均一；核膽酸受體FXR mRNA及蛋白表達(dá)水平亦明顯受抑。 4．CPB術(shù)后早期存在著肝細(xì)胞GHR mRNA及蛋白表達(dá)水平不同程度的下降；STAT5 mRNA、蛋白表達(dá)水平及活性水平也下降；以CPB后3h最為明顯；STAT5活

12、性下降與GHR抵抗有關(guān)。而且，肝損害與STAT5活性下降及GHR抵抗均相關(guān)。 5．STAT5上調(diào)途徑對(duì)CPB后肝細(xì)胞的影響。GH預(yù)處理可上調(diào)STAT5表達(dá)活性，直接調(diào)控HMTs的表達(dá)，提高核膽酸受體FXR的活性，促進(jìn)膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)，降低高膽紅素血癥對(duì)肝細(xì)胞的損害；同時(shí)STAT5的上調(diào)可降低肝臟炎癥反應(yīng)，增加肝臟結(jié)構(gòu)蛋白，降低肝臟急性期反應(yīng)，抑制凋亡，促進(jìn)再生，改善肝臟功能。 結(jié)論： 1．我們成功建立了大鼠閉胸式CPB模

13、型。利用顯微外科器械，采用微型化CPB環(huán)路設(shè)備，經(jīng)右頸靜脈腔房引流、左頸動(dòng)脈灌注方法建立大鼠閉胸式CPB模型比較符合生理，具有較好的穩(wěn)定性和可靠性，是進(jìn)行CPB術(shù)后肝臟病理生理改變研究的理想動(dòng)物模型。 2．CPB可導(dǎo)致明顯的肝細(xì)胞損害。表現(xiàn)為(1)肝功能受損，ALT、TB增高；血清肝臟結(jié)構(gòu)蛋白濃度降低；血清急性期反應(yīng)蛋白濃度增加，肝細(xì)胞凋亡增加，炎性細(xì)胞浸潤等。(2)CPB導(dǎo)致肝細(xì)胞膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)存在障礙。表現(xiàn)為CPB早期各種HMTs

14、的mRNA及蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)不同程度的下降和不均一；核膽酸受體FXR mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯受抑。肝細(xì)胞NTCP，BSEP等HMTs和核膽酸受體FXR的表達(dá)程度的下降和不均一是CPB術(shù)后肝細(xì)胞損害的重要原因之一。肝細(xì)胞內(nèi)膽紅素蓄積、過度炎性反應(yīng)和急性期反應(yīng)(APR)、FXR表達(dá)受抑和GH抵抗導(dǎo)致的STAT5活性下調(diào)共同介導(dǎo)了HMTs的表達(dá)的不均一； 3．GH預(yù)處理有望成為預(yù)防和減輕CPB過程中肝細(xì)胞損害及SIRS的新策略。G