細(xì)胞凋亡在2,5-己二酮誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性變性中的作用.pdf

1、2,5-己二酮(HD)是重要的工業(yè)有機(jī)溶劑正己烷的活性代謝產(chǎn)物，介導(dǎo)了正己烷誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性病變，其具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)建立大鼠HD亞慢性中毒模型，測(cè)定神經(jīng)組織中關(guān)鍵的凋亡調(diào)控蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3含量變化，對(duì)中樞神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行凋亡形態(tài)學(xué)和生化檢測(cè)，研究細(xì)胞凋亡機(jī)制是否參與了HD誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性變，為進(jìn)一步探討HD的神經(jīng)毒性機(jī)制提供依據(jù)。 方法 Wistar雄性成年大鼠60只隨機(jī)分為對(duì)照組

2、、低劑量組和高劑量組，分別腹腔注射生理鹽水、200mgHD/kg體重和400mgHD/kg體重，每周5次，連續(xù)2個(gè)月。每周觀察大鼠中毒表現(xiàn)，測(cè)量體重、熱覺(jué)傳導(dǎo)、壓痛閾值、后肢撐力、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)等指標(biāo)。采用Westernblotting方法分析各實(shí)驗(yàn)組大腦、小腦、脊髓和坐骨神經(jīng)中Bax、Bcl-2和Caspase-3含量變化，用免疫組織化學(xué)方法原位檢測(cè)大腦、小腦和脊髓組織中的Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)，并用蘇木素-伊紅染色(HE)和TUNE

3、L方法分析大腦、小腦和脊髓組織中神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)和DNA改變。 結(jié)果 一、體重及神經(jīng)功能測(cè)試 HD染毒后大鼠體重顯著降低，并且隨劑量的升高，呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，與對(duì)照組相比，低劑量組體重降低了20％(P＜0.01)，高劑量組體重降低了43％(P＜0.01)。與對(duì)照組相比，高劑量組在熱板儀上的保持時(shí)間有延長(zhǎng)的趨勢(shì)(延長(zhǎng)了23％)，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，高劑量組壓痛閾值顯著增加了18％(P＜

4、0.05)，低劑量組在熱板儀上的保持時(shí)間和壓痛閾值都變化不明顯(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，第4周時(shí)高劑量組的后肢撐力指數(shù)明顯增加了46％(P＜0.01)，第6周時(shí)，低劑量組的后肢撐力指數(shù)增加了15％(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，第3周時(shí)高劑量組和低劑量組大鼠在轉(zhuǎn)軸上的平衡時(shí)間分別顯著縮短了62％(P＜0.01)、49％(P＜0.05)。 二、Westernblotting結(jié)果 HD染毒后，除脊髓組織中Bax、Bcl

5、-2和Caspase-3含量變化不明顯外，其他中樞和周?chē)窠?jīng)組織中的Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比都顯著升高。 1.大腦組織：與對(duì)照組相比，低劑量組Bax的表達(dá)升高了48％(P＜0.01)，高劑量組升高了65％(P＜0.01)；低劑量組Bcl-2表達(dá)水平升高了30％(P＜0.01)，高劑量組升高了52％(P＜0.01)；低劑量組Caspase-3的表達(dá)水平升高了30％(P＜0.05)，高劑量組升高了

6、78％(P＜0.01)。 2.小腦組織：與對(duì)照組相比，高劑量組小腦組織中的三種蛋白表達(dá)均顯著升高，Bax升高了33％(P＜0.05)，Bcl-2升高了39％(P＜0.01)，Caspase-3升高了182％(P＜0.01)。低劑量組中的Caspase-3蛋白水平比對(duì)照組升高了126％(P＜0.05)，而B(niǎo)ax和Bcl-2蛋白水平變化不明顯。 3.脊髓組織：各染毒組脊髓中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白水平與對(duì)照

7、組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 4.坐骨神經(jīng)：與對(duì)照組相比，低劑量組Bax蛋白水平升高了67％(P＜0.01)、高劑量組升高了79％(P＜0.01)；低劑量組Bcl-2蛋白水平升高了41％(P＜0.01)，高劑量組Bcl-2升高了27％(P＜0.01)；低劑量組Caspase-3升高了44％(P＜0.05)，高劑量組升高了283％(P＜0.01)。 三、免疫組織化學(xué)結(jié)果 免疫組化顯示，HD染毒后中樞神經(jīng)系統(tǒng)(

8、大腦、小腦和脊髓組織)神經(jīng)細(xì)胞的Bax和Bcl-2蛋白含量顯著升高。 1.大腦組織：與對(duì)照組相比，低劑量組Bax蛋白水平升高了20％(P＜0.05)，Bcl-2蛋白升高了24％(P＜0.05)；高劑量組Bax蛋白水平升高了41％(P＜0.05)，Bcl-2蛋白升高了91％(P＜0.01)。 2.小腦組織：與對(duì)照組相比，低劑量組Bax的水平變化不明顯，Bcl-2表達(dá)顯著增加了43％(P＜0.01)；高劑量組中Bax和Bcl

9、-2的表達(dá)水平分別升高了24％(P＜0.01)、62％(P＜0.01)。 3.脊髓組織：與對(duì)照組相比，低劑量組Bax蛋白水平升高了67％(P＜0.01)、Bcl-2蛋白升高了36％(P＜0.05)；高劑量組的Bax蛋白水平升高了33％(P＜0.05)，Bcl-2蛋白升高了31％(P＜0.05)。 四、HE和TUNEL檢測(cè) 光鏡下，低劑量組和高劑量組的中樞神經(jīng)組織(大腦、小腦和脊髓)細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)改變，也

10、未見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，無(wú)顯著的DNA斷裂現(xiàn)象。 結(jié)論 1.HD具有明顯的神經(jīng)毒性，影響了大鼠的神經(jīng)感覺(jué)功能和運(yùn)動(dòng)功能。 2.首次發(fā)現(xiàn)HD可誘導(dǎo)中樞和周?chē)窠?jīng)組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3表達(dá)升高。并且，三種蛋白中Caspase-3升高幅度顯著高于Bax和Bcl-2蛋白。 3.與其他神經(jīng)組織相比，HD染毒后，坐骨神經(jīng)中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3含量變化最為