2,5-己二酮致人卵巢顆粒細胞凋亡及Sonichedgehog信號通路調(diào)控機制的研究.pdf

1、正已烷(n-hexane，CAS：110-54-3)，別名己烷，屬于直鏈飽和脂肪烴類，2,5-己二酮(2,5-hexanedione，2,5-HD)是正己烷體內(nèi)代謝的主要活性產(chǎn)物，與正己烷的毒性有關(guān)。正己烷作為有機溶劑被廣泛應用的同時，如職業(yè)接觸防護不當，特別是女工職業(yè)接觸機會較多，會導致器官結(jié)構(gòu)與功能的損傷。國內(nèi)外對正己烷和2,5-HD毒性作用進行了較為廣泛地研究，但主要集中在神經(jīng)毒性方面，對生殖系統(tǒng)的毒理損傷，尤其是對女性生殖功能的

2、影響報道較少，其毒性作用機制還有待進一步認識。2005年，有學者首次報道了來源于小鼠卵巢顆粒細胞的Hedgehog信號通路，隨后研究較多的是Sonic hedgehog(SHH)。SHH信號通路對許多組織細胞增殖、分化、凋亡的調(diào)控以及在生殖腺(睪丸、卵巢)、子宮和附屬性腺(前列腺、乳腺)等生殖系統(tǒng)中的研究是近幾年的熱點。因此，本研究采用體外培養(yǎng)的人卵巢顆粒細胞為靶細胞，通過建立和優(yōu)化體外分離和培養(yǎng)人卵巢顆粒細胞的培養(yǎng)體系，研究2,5-H

3、D致人卵巢顆粒細胞凋亡的作用機制及SHH信號通路在該過程中的調(diào)控作用，可以為明確2,5-HD對女性生殖功能的毒性損傷、作用機理以及涉及該通路的調(diào)控機制提供重要的參考依據(jù)，以期為進一步開展緩解或阻斷2,5-HD致卵巢毒性損傷的研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　通過建立高效、穩(wěn)定的體外分離、培養(yǎng)、鑒定人卵巢顆粒細胞的研究體系，從人卵巢顆粒細胞凋亡的形態(tài)學變化及與細胞凋亡有關(guān)的BCL-2家族(BCL-2、BAX)和CASPASE

4、家族(CASPASE-3)的表達變化，探討2,5-HD致卵巢毒性的作用機制。同時，研究Sonic hedgehog信號通路在2,5-HD致人卵巢顆粒細胞凋亡過程中的作用方式及其作用機制，為進一步研究如何緩解或阻斷2,5-HD致卵巢毒性損傷提供新思路。
　　方法：
　　1.分離行輔助生殖助孕技術(shù)治療的、符合研究納入標準的、不孕患者的卵巢顆粒細胞，采用梯度離心、紅細胞裂解液裂解及胰蛋白酶消化等方法，分離人卵巢顆粒細胞。同時，采用

5、蘇木素-伊紅(HE)染色、促卵泡生成素受體(FSHR)免疫組化染色對分離細胞進行鑒定，采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，并對體外培養(yǎng)細胞的雌二醇(E2)、孕酮(P)分泌功能進行測定。
　　2.以體外培養(yǎng)48h的人卵巢顆粒細胞為靶細胞，采用2,5-HD終濃度為0、16μmol/L、64μmol/L和256μmol/L的DMEM培養(yǎng)液體外染毒24h，通過采用HE染色、Hoechst33342熒光染色、CASPASE-3 p17免疫組化

6、染色、透射電鏡以及流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測2,5-HD誘導人卵巢顆粒細胞凋亡的改變。再進一步采用realtime PCR和Western blot法，分別檢測與細胞凋亡有關(guān)的BCL-2家族(BCL-2、BAX)和CASPASE家族(CASPASE-3)的mRNA、蛋白水平隨著2,5-HD染毒濃度的增加其表達量的變化情況。
　　3.選擇研究致人卵巢顆粒細胞凋亡效應最顯著的256μmol/L2,5-HD體

7、外染毒24h過程的顆粒細胞和正常對照組顆粒細胞為研究對象，采用realtime PCR，測定內(nèi)源性SHH信號通路在2,5-HD作用24h致人卵巢顆粒細胞凋亡過程中的mRNA的表達改變；采用Western blot法，測定內(nèi)源性SHH信號通路主要效應分子SHH、GLI1在2,5-HD作用24h致人卵巢顆粒細胞凋亡過程中的蛋白表達改變情況。同時，通過測定外源性重組SHH因子和SHH信號通路阻滯劑Cyclopamine對SHH信號通路的激活或

8、阻斷，來進一步驗證SHH信號通路對2,5-HD致人卵巢顆粒細胞凋亡率的影響，以及對抗凋亡基因BCL-2和凋亡基因BAX mRNA、蛋白的影響。
　　結(jié)果：
　　1.人卵巢顆粒細胞分離、原代培養(yǎng)與鑒定體系的建立：(1)臺盼藍染色顯示實驗分離的人卵巢顆粒細胞存活率>90％，細胞表達FSHR的陽性率>95%。(2)光鏡下觀察到，人卵巢顆粒細胞體外生長速度較慢，培養(yǎng)2d后細胞明顯增殖，細胞與細胞之間有絲狀突起相連；第6-7d時細胞逐

9、漸變形、退化。(3)采用CCK-8法測定細胞增殖曲線顯示，人卵巢顆粒細胞隨著體外培養(yǎng)時間的延長而增殖,培養(yǎng)24h時細胞處于貼壁生長期，在培養(yǎng)第3-5d時達到分裂高峰，隨后第6-7d細胞開始逐漸退化。(4)體外培養(yǎng)的人卵巢顆粒細胞在重組人促卵泡激素(rFSH)作用下可明顯促進E2的分泌，但分泌孕酮(P)的能力與rFSH的作用無關(guān)，體外分離、原代培養(yǎng)的人卵巢顆粒細胞保持了原有細胞的功能特性。
　　2.2,5-HD致人卵巢顆粒細胞凋亡機

10、制的研究：本研究建立了2,5-HD誘導的人卵巢顆粒細胞凋亡模型，由相差顯微鏡、光鏡、熒光顯微鏡和透射電鏡可觀察到特征性的凋亡形態(tài)學改變，且隨著2,5-HD染毒濃度的增加出現(xiàn)凋亡形態(tài)學改變的人卵巢顆粒細胞會逐漸增多。流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示，2,5-HD終濃度為64μmol/L、256μmol/L時可顯著增加顆粒細胞的凋亡率。realtime PCR結(jié)果顯示，隨著2,5-HD染毒濃度的增加，BCL-2 m

11、RNA水平呈下降趨勢，BAX、CASPASE-3 mRNA水平呈上升趨勢。Western blot與realtime PCR結(jié)果相一致，表現(xiàn)為隨著2,5-HD染毒濃度的增加，BCL-2蛋白表達呈下降趨勢，凋亡蛋白BAX、凋亡下游執(zhí)行蛋白CASPASE-3(p17)表達呈上升趨勢。
　　3.Sonic hedgehog信號通路在2,5-HD致人卵巢顆粒細胞凋亡過程中的調(diào)控作用：(1)對照組人卵巢顆粒細胞在體外培養(yǎng)過程中，有少量SHH

12、信號通路組分表達，但隨時間改變無明顯改變；在2,5-HD作用24h過程中，顆粒細胞SHH、PTCH1、SMO以及GLI1 mRNA水平在3h、6h時分別與對照組比較差異顯著；SHH、SMO和GLI1mRNA水平在24h時均有下降；GLI2和GLI3 mRNA水平與對照組比較在不同時間差異均無統(tǒng)計學意義；人卵巢顆粒細胞SHH、PTCH1、SMO以及GLI1mRNA水平在3h、6h時升高分別為對照組的2-5倍、5-8倍，隨后于24h時降到低

13、值。(2)與realtime PCR結(jié)果相一致，對照組人卵巢顆粒細胞在體外培養(yǎng)過程中， SHH信號通路主要效應分子SHH、GLI1蛋白有少量表達，隨時間改變無明顯差異；在2,5-HD作用24h過程中，顆粒細胞SHH和GLI1蛋白水平在3h、6h時升高分別與對照組比較差異顯著，在24h時均有下降。(3)外源性SHH因子可增加人卵巢顆粒細胞的存活率，減少2,5-HD作用導致的細胞凋亡；用外源性Cyclopamine阻滯SHH信號通路會增加人

14、卵巢顆粒細胞的凋亡率。(4)在2,5-HD致人卵巢顆粒細胞凋亡過程中采用外源性重組SHH因子處理會導致抗凋亡基因BCL-2表達上調(diào)，凋亡基因BAX表達下降。
　　結(jié)論：
　　1.采用本研究所建立的方法可獲得生長活性較好、細胞純度高及穩(wěn)定的人卵巢顆粒細胞，用HE染色和FSHR免疫組化染色法可簡便快速地鑒定人卵巢顆粒細胞。
　　2.2,5-HD通過誘導人卵巢顆粒細胞BCL-2家族中凋亡基因(BAX)表達上升和抗凋亡基因(B

15、CL-2)表達下降，引起凋亡下游執(zhí)行蛋白 CASPASE-3(p17)表達上升，進而導致顆粒細胞的凋亡增加，有可能是其致卵巢功能受損的機制之一，明確BCL-2家族對2,5-HD致人卵巢顆粒細胞凋亡的作用機制，可以為女性生殖毒性損傷的臨床診斷、確定分子治療靶點的研究提供參考依據(jù)。
　　3.體外培養(yǎng)的人卵巢顆粒細胞有少量SHH信號通路組分表達。在2,5-HD致人卵巢顆粒細胞凋亡過程中SHH信號通路會被激活，起到了降低顆粒細胞凋亡的保護