諾西肽新型產(chǎn)生菌株游動放線菌的初步鑒定及其核糖體工程選育.pdf

1、諾西肽作為噻唑肽類家族中的重要成員，于19世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)。它對革蘭氏陽性菌包括耐甲氧西林青霉素、鏈霉素、四環(huán)素在內(nèi)的金黃色葡萄球菌都有良好的抑菌活性。由于諾西肽促進(jìn)動物腸道吸收及動物生長并具有毒性低，在動物體內(nèi)殘留少的優(yōu)點(diǎn)，我國于1998年將其批準(zhǔn)為三類新獸藥。通過化學(xué)后修飾等對其進(jìn)行改造，闡明藥效基團(tuán)及生物活性的關(guān)系并在此基礎(chǔ)上增加相應(yīng)的水溶性及穩(wěn)定的藥代動力學(xué)性質(zhì)，促成開發(fā)為人用抗生素也一直受到藥物化學(xué)家的追捧。近幾年來，隨著新

2、型人獸共患病的增加，由動物患病引起的公共衛(wèi)生事件被前所未有的足夠重視；除此而外，以那些以前未被人用的，結(jié)構(gòu)獨(dú)特新穎及其生物活性明確的天然產(chǎn)物作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行化學(xué)修飾被認(rèn)為是開發(fā)新型抗生素開發(fā)策略的一大捷徑。在這樣的背景下，諾西肽憑借其新奇的化學(xué)結(jié)構(gòu)，獨(dú)特的抗菌機(jī)制及強(qiáng)抗菌活性，且不易與其它抗生素產(chǎn)生交叉耐藥等優(yōu)點(diǎn)，受到了藥物開發(fā)者的親睞，顯示了極佳的開發(fā)價值與市場需求。
　　 諾西肽的產(chǎn)生菌目前報道的主要有活躍鏈霉菌、抗生鏈霉

3、菌和青灰色鏈霉菌三種?？股溍咕鳛楣I(yè)發(fā)酵生產(chǎn)諾西肽的主要菌株，經(jīng)過傳統(tǒng)誘變育種以及發(fā)酵條件的優(yōu)化，我國目前的發(fā)酵水平約為2000mg/ml，落后于歐美和日本等國。因此，尋找更具潛力的新型產(chǎn)生菌株，并進(jìn)行菌種改良，并以此為契機(jī)大幅度提高諾西肽的產(chǎn)量，以滿足日益增長的市場需求顯得迫在眉睫。前期發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)篩選結(jié)果顯示，在四川抗菌素研究所分離得到的一株放線菌中具有微弱的諾西肽產(chǎn)生能力(本實(shí)驗(yàn)將此菌株命名為IMB007)，但經(jīng)過傳統(tǒng)的遺傳

4、育種手段并未得到諾西肽產(chǎn)生能力提高的理想突變株。因此，本研究著力于探討是否可以通過核糖體工程育種方法，篩選到高產(chǎn)諾西肽的生產(chǎn)菌株，為今后的發(fā)酵調(diào)控研究提供理想的出發(fā)菌株。核糖體工程育種技術(shù)是由Ochi等人于2000年提出。該技術(shù)主要通過單獨(dú)和組合選擇對微生物進(jìn)行理性的耐藥突變與篩選，在誘導(dǎo)核糖體結(jié)構(gòu)的改變的同時，激活了其代謝產(chǎn)物生物合成調(diào)控系統(tǒng)，從而使得菌株產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的能力大幅度提高或是產(chǎn)生以前母本菌株原本不產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，相比于

5、以往的隨機(jī)突變及理性篩選，該方法達(dá)到了事半功倍的效果，在微生物遺傳育種方面顯示了良好的應(yīng)用前景。
　　 首先，根據(jù)形態(tài)特征觀察，細(xì)胞壁脂肪酸成分分析，并結(jié)合16s rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析對菌株IMB007進(jìn)行了分類鑒定。細(xì)胞壁成分分析表明該菌株脂肪酸成分主要為16碳的飽和脂肪酸，符合游動放線菌的2型特征。16s rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建也證實(shí)了該菌株與游動放線菌Actinoplanes-sp.03-723-16s-rib的親緣性最

6、高。其次，我們采用核糖體工程技術(shù)對該菌種進(jìn)行遺傳改良，首輪分別用2倍MIC值的鏈霉素和利福平進(jìn)行單一抗性篩選，得到發(fā)酵單位提高1.99倍的鏈霉素抗性突變株S63以及發(fā)酵單位提高1.89倍的利福平抗性突變株R59。第二輪組合鏈霉素和利福平進(jìn)行2倍MIC抗性篩選，得到突變菌株SR-14，發(fā)酵單位達(dá)到原始菌株的7.9倍。最后，經(jīng)過4輪傳代考察，該菌株的發(fā)酵性能仍能保持穩(wěn)定。
　　 以上結(jié)果表明，突變株SR-14發(fā)酵產(chǎn)諾西肽水平相比原始