非核糖體多肽的特征分析與環(huán)孢菌高產(chǎn)菌種的誘變選育.pdf

1、非核糖體多肽(nonribosomal peptides，NRPs)是通過非核糖體途徑合成的一系列低分子量、具有多種藥用價值的多肽類次生代謝產(chǎn)物。目前自然界中已發(fā)現(xiàn)的NRPs有1071種，對這些NRPs的組成、結(jié)構(gòu)、功能和來源進行分析，旨在對未知功能NRPs的生物學功能進行預測，并設計出具有特定生物學功能的多肽。研究過程采用基本統(tǒng)計學方法和生物信息學方法，對不同結(jié)構(gòu)、功能、來源中NRPs的數(shù)量進行統(tǒng)計，采用相關(guān)分析法分析結(jié)構(gòu)、功能和來源

2、之間的聯(lián)系，通過對氨基酸使用頻率的計算，闡明非核糖體多肽在氨基酸組成上的特點，以及這些特點與其結(jié)構(gòu)、功能和來源的聯(lián)系。
　　取得的主要研究結(jié)果如下：
　　1.非核糖體多肽的氨基酸單體數(shù)目分布在2～49范圍內(nèi)，集中分布于六肽～十一肽；其結(jié)構(gòu)分為環(huán)狀和鏈狀，環(huán)狀比例為69.7％，以單環(huán)狀(40.5％)和部分環(huán)狀(26.7％)為主；除peptide是主要類型(58.5％)外，還有l(wèi)ipopeptide，peptaibol和glyc

3、opeptide三種常見的多肽亞類，lipopeptide多作為抗菌素和表面活性劑使用，peptaibol和glycopeptide作用均為抗菌素；NRPs的功能以抗菌素(35.67％)和毒素(18.58％)最為常見，這與生物對外界環(huán)境的適應性有關(guān)，此外還有載鐵蛋白、抗腫瘤、免疫抑制劑和表面活性劑等功能及其復合功能；NRPs主要來源于微生物，以細菌(49.21％)和真菌(25.30％)為主，此外，海綿動物(Porifera)來源的NRP

4、s占19.14％。
　　2.行使載鐵蛋白功能的多肽結(jié)構(gòu)為鏈狀和分枝狀，其中分枝狀多肽只行使載鐵蛋白功能，推測鏈狀和分枝狀結(jié)構(gòu)在載鐵蛋白與鐵離子結(jié)合的過程中發(fā)揮作用；來源于革蘭氏陽性菌和海綿動物的NRPs在結(jié)構(gòu)上有顯著相關(guān)性(p<0.05)，推測海綿動物體內(nèi)的NRPs可能是與海綿動物共生的革蘭氏陽性菌產(chǎn)生的。載鐵蛋白和表面活性劑功能的NRPs只來源于細菌，主要是革蘭氏陰性菌.(97.18％，73.91％)，表明真核生物體內(nèi)不能合成載

5、鐵蛋白和表面活性劑功能的NRPs。
　　3.脯氨酸(Pro)作為NRPs中使用頻率最高的氨基酸，具有形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)、維持構(gòu)象穩(wěn)定的作用；蘇氨酸(Thr)在連接環(huán)與環(huán)、鏈與鏈、鏈與環(huán)結(jié)構(gòu)中起重要作用；非核糖體多肽的合成必須進行修飾，對多肽鏈的修飾使多肽鏈環(huán)化，對氨基酸單體的修飾常見的有差向異構(gòu)修飾(D-修飾)和N端甲基化修飾(NMe-修飾)：NMe-修飾在環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的使用頻率(15.43％)顯著高于線狀結(jié)構(gòu)(4.04％)，隨著多肽分子

6、中環(huán)狀結(jié)構(gòu)比例的增加，NMe-修飾的頻率也增加。非蛋白質(zhì)氨基酸在環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的使用頻率(35.3％)低于鏈狀結(jié)構(gòu)(19.3％)，隨著多肽分子中環(huán)狀結(jié)構(gòu)比例的增加，NMe-修飾的頻率減小，NMe-修飾氨基酸使用頻率與非蛋白質(zhì)氨基酸使用頻率呈顯著負相關(guān)(p<0.05)；真菌中的D-修飾頻率(3.6％)顯著偏低，說明真菌在合成NRPs時對差向異構(gòu)修飾的需求不高；細菌中的NMe-修飾頻率(4.21％)亦偏低，說明細菌對N端甲基化修飾的需求也不高；

7、載鐵蛋白沒有NMe-修飾，說明載鐵蛋白的合成不需要N端甲基化修飾，相反，免疫抑制劑和表面活性劑的NMe-修飾顯著偏高(21.59％，27.53％)，相關(guān)性分析表明，行使免疫抑制劑和表面活性劑功能的NRPs在各類氨基酸的使用頻率上有顯著相關(guān)性(p<0.05)。
　　根據(jù)研究結(jié)果，我們總結(jié)出NRPs在組成、結(jié)構(gòu)、功能與來源上的主要規(guī)律有：
　　(1)在氨基酸數(shù)目上，抗菌素多肽的氨基酸數(shù)目在2～20均有分布，其余功能的多肽數(shù)目在1

8、3以下，其中抗腫瘤多肽沒有二肽、六肽、十一肽、十二肽，毒素沒有三肽，免疫抑制劑只有三肽、四肽、七肽、八肽、九肽、十一肽，載鐵蛋白沒有五肽，表面活性劑只有四肽、五肽、六肽、八肽和九肽；
　　(2)在多肽結(jié)構(gòu)上，抗菌素無分枝狀結(jié)構(gòu)，抗腫瘤多肽無雙環(huán)、分枝狀結(jié)構(gòu)，毒素無分枝狀結(jié)構(gòu)，免疫抑制劑無雙環(huán)、鏈狀、分枝狀結(jié)構(gòu)，載鐵蛋白無單環(huán)、雙環(huán)結(jié)構(gòu)，表面活性劑無雙環(huán)、部分環(huán)、分枝狀結(jié)構(gòu)。分枝狀多肽只行使載鐵蛋白功能：
　　(3)在生物體來

9、源上，抗菌素無腔腸動物來源，抗腫瘤多肽無植物、脊索動物和腔腸動物來源，毒素無脊索動物來源，免疫抑制劑無細菌、軟體動物、脊索動物、腔腸動物來源，載鐵蛋白和免疫抑制劑只來源于細菌；
　　(4)在氨基酸的使用上，抗菌素多肽不使用Met，抗腫瘤類NRPs不使用His，Lys，Asp，Glu，毒素類NRPs不使用Ala，Leu，Phe，Trp，Cys，Gln，免疫抑制劑類NRPs不使用Met，Ser，Thr，Cys，Ash，Gln，His，

10、Lys，Asp，Arg，載鐵蛋白類NRPs不使用Leu，Ile，Phe，Trp，Pro，Met，Cys，His，表面活性劑類NRPs不使甩Phe，Trp，Gly，Cys，Tyr，His，Lys，Arg；
　　(5)在對氨基酸的D-修飾上，抗菌素無D-Met，D-Gln，D-His，抗腫瘤多肽無D-Met，D-Gly，D-Tyr，D-His，D-Lys，D-Arg，D-Glu，毒素類多肽無D-Trp，D-Met，D-Gly，D-Gl

11、n，D-His，D-Lys，免疫抑制劑僅有D-Ala，D-Val，D-Ile，載鐵蛋白無D-Val，D-Leu，D-Ile，D-Phe，D-Trp，D-Pro，D-Met，D-Gly，D-Cys，D-Asn，D-His，D-Arg，表面活性劑僅有D-Leu，D-Phe，D-Tyr；
　　(6)在對氨基酸的NMe-修飾上，抗菌素有NMe-Ala，NMe-Val，NMe-Leu，NMe-Ile，NMe-Phe，NMe-Gly，NMe-

12、Tyr，NMe-Gln，抗腫瘤多肽有NMe-Ala，NMe-val，NMe-Leu，NMe-Phe，NMe-Gly，NMe-Tyr，NMe-Asn，NMe-Gln，毒素類多肽有NMe-Ala，NMe-Val，NMe-Leu，NMe-Ile，NMe-Phe，NMe-Trp，NMe-Gly，NMe-Ser，NMe-Tyr，NMe-Asn，NMe-Gln，免疫抑制劑只有NMe-Val，NMe-Leu，NMe-Gly，表面活性劑只有NMe-Al

13、a，NMe-Val，NMe-Phe，NMe-Gly，NMe-Tyr，載鐵蛋白沒有NMe-氨基酸；
　　以上例舉的主要是NRPs功能方面的規(guī)律，此外結(jié)構(gòu)、來源方面還有其他很多規(guī)律，如真菌來源NRPs不含Phe以及酸性和堿性氨基酸，革蘭氏陽性菌來源的NRPs不含Ile，完全由蛋白質(zhì)氨基酸構(gòu)成的環(huán)狀多肽首尾必須至少有一個Pro，分枝狀結(jié)構(gòu)多肽不使用NMe-修飾，等等。
　　這些規(guī)律對我們預測NRPs的功能和指導環(huán)肽類藥物的設計具有