硫代乙酰胺誘導豚鼠肝纖維化及膽囊病變的實驗研究.pdf

1、肝纖維化(Liverfibrosis)指的是肝臟慢性損傷后，肝臟內纖維組織異常增生，在組織損害持續(xù)或修復過程中形成肉芽組織，此后細胞成分減少而纖維組織增加，導致肝臟病理學上的一系列改變。我國是肝炎肝硬化高發(fā)區(qū)，晚期肝硬化患者大部分死于其并發(fā)癥，而膽囊病變是其中嚴重的并發(fā)癥，目前臨床上常碰到一部分肝硬化病人合并膽囊病變，特別是晚期肝硬化合并有急性膽囊炎、慢性膽囊炎、膽囊結石等，在治療上往往存在許多矛盾，手術風險極大等難題。而肝纖維化作為肝

2、硬化發(fā)展的必經(jīng)階段的病理過程，其進展至肝硬化過程中是否存在同步的膽囊功能病理組織學的改變。以及兩者在病理狀態(tài)下的相互關系、相互影響，尤其是膽囊病變有否促進肝硬化的發(fā)展，膽囊切除術后肝功能變化、肝硬化的轉歸機制及學說并不明確，為了更好地防治肝硬化合并膽囊病變，有必有對其發(fā)生、發(fā)展、轉歸機理作一研究。因而建立肝纖維化、肝硬化合并膽囊病變動物模型顯得很有必要。目前國內外尚無建立此類模型成熟穩(wěn)定的方法。 目的：1在體重監(jiān)測下觀察硫代乙酰

3、胺(TAA)誘導豚鼠肝纖維發(fā)展過程的穩(wěn)定性及可行性，觀察豚鼠對TAA毒性作用的耐受性及易感性。體重變化與肝纖維化成模是否存在關系，體重監(jiān)測在成模過程中的作用。為進一步建立成模率高、病理變化穩(wěn)定的肝硬化合并膽囊病變模型提供簡便、無創(chuàng)、經(jīng)濟的監(jiān)測手段。 2分析豚鼠肝臟病理纖維化分級與血清纖維化指標水平是否存在相關性，為豚鼠肝硬化模型建立提供適用的監(jiān)測手段及提供理論依據(jù)。 3初步觀察肝纖維化過程中膽囊出現(xiàn)的病理變化，為肝硬化合

4、并膽囊病變模型研究作前期探索。 材料和方法：1取體重在250-300g(約3-4周齡)健康雄性豚鼠50只，隨機分成兩組：對照組10只；實驗組40只(其中TAA作用模型六周組20只，作用模型九周組20只)。5只/籠分籠飼養(yǎng)。對照組、實驗組均予豚鼠基礎飼料，不限量供應。對照組不限量供應750mg/LVitC飲用水；實驗組予含濃度為0.03％TAA+750mg/LVitC飲用水誘導并不限量供應，配制后Ph值應為6.7～7.2，保證TA

5、A的化學穩(wěn)定性。各組飲用水每兩天配制更換。 2體重監(jiān)測：每周同一天同一時段測體重。 3血清、肝臟、膽囊取材保存3.1飼養(yǎng)第七周末、第十周末用同法處理模型六周組、模型九周組與對照組，利用乙醚吸入麻醉后體外心臟穿刺采血(3-5ml)，剖腹后肝臟下緣上翻，靠近膽總管結扎膽囊管，再游離切斷肝臟血管及與周圍組織器官韌帶，完整取出肝臟及膽囊，不結扎肝臟相關離斷血管放血處死。離體解剖分離肝臟、膽囊。肝組織取自肝右外側葉1.5×1.5×

6、0.3cm3大小固定在10％甲醛固定液中，用于常規(guī)伊紅-蘇木素(HE)染色，Masson三色染色、Gomori銀染色法。根據(jù)肝組織內纖維組織增生狀況分為5級：(S0無纖維化；S1門管區(qū)纖維化擴大，局限竇周及小葉內纖維化；S2門管區(qū)周圍纖維化，伴纖維間隔形成，小葉結構保留；S3纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化；S4早期肝硬化。)。統(tǒng)計各組各個體肝纖維化程度。 3.2膽囊常規(guī)HE染色，觀察膽囊病理改變及外觀情況。4血液標本4000r

7、pm離心15min，取其血清600ul置于-20℃冰箱保存?zhèn)錂z。采用放射免疫分析法測定各標本透明質酸(HA)、層粘蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(ⅣC)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)血清值。嚴格按各試劑盒使用說明書操作，由SN-697全自動雙探頭放射免疫γ計數(shù)器測沉淀物放射性計數(shù)。5統(tǒng)計分析：所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(-x±s)表示。用SPSS11.0軟件進行多組資料t檢驗、相關分析、Fisher精確檢驗法，P＜0.05即認為差異有顯著的統(tǒng)計學意義。

8、 結果：1體重監(jiān)測1.1第一周體重：對照組、實驗組按正常生理變化規(guī)律體重逐漸上升，體重增加平穩(wěn)。 1.2第二周后(實驗組予TAA一周后)：對照組體重按生理規(guī)律體重變化逐漸上升，體重增加平穩(wěn)，豚鼠毛發(fā)順暢光澤好、食欲正常、活動正常。實驗各組：體重明顯下降，幅度最大者超過80g，豚鼠毛發(fā)出現(xiàn)蓬松、食欲不振下降、活動減少，尤以體重變化大者為甚。第三、四周后體重緩慢回升，以后呈小幅度升降，個別逐漸上升。豚鼠毛發(fā)色澤、食欲、活動逐漸好

9、轉。 1.3對照組與實驗組組間體重均數(shù)比較：第二周：模型六周組、模型九周組VS對照組，P＞0.05，各組間體重均數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義。第七周：模型六周組、模型九周組VS對照組，P＜0.05，對照組與實驗模型各組比較差異有顯著的統(tǒng)計學意義。模型六周組VS模型九周組，P＞0.05，實驗模型組間差異無統(tǒng)計學意義。各實驗組內個體體重變化存在差異。 2HA、LN、ⅣC、PCⅢ血清值2.1對照組：HA(250.71±72.37μg

10、/L)、LN(35.39±10.01μg/L)、ⅣC(6.21±3.08μg/L)、PCⅢ(2.86±1.94μg/L)；模型六周組：HA(233.64±67.62μg/L)、LN(44.61±12.88μg/L)、ⅣC(8.52±2.40μg/L)、PCⅢ(87.49±32.95μg/L)；模型九周組：HA(85.59±35.99μg/L)、LN(40.90±8.44μg/L)、ⅣC13.40±1.93μg/L)、PCⅢH(158.6

11、8±41.73μg/L)。 2.2Ⅳ型膠原值、Ⅲ型前膠原值均數(shù)比較：對照組、模型六周組、模型九周組相繼遞增，各組間t檢驗P＜0.05，差異有顯著的統(tǒng)計學意義；透明質酸值均數(shù)比較：對照組、模型六周組、模型九周組相繼下降，各組間t檢驗P＜0.05，差異有顯著的統(tǒng)計學意義；層粘蛋白值均數(shù)比較：對照組、模型六周組、模型九周組變化不大，各組間t檢驗P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義。 3肝臟組織病理改變與纖維化分級3.1大體觀察：對照

12、組肝臟質地軟、紅潤，實驗組肝臟顏色不同程度變深，淺褐色，質地稍韌。 3.2顯微鏡觀察：3.2.1對照組：肝細胞、肝細胞索、肝小葉結構正常。在門管區(qū)和小葉中央靜脈有少量的膠原纖維。 3.2.2模型六周組：出現(xiàn)斑片狀肝細胞壞死區(qū)，壞死區(qū)有較多炎性細胞浸潤，自門靜脈周圍向外蔓延，并有中央靜脈周圍少量炎性細胞的浸潤，肝細胞核稍增大；炎癥反應進一步加重；肝細胞壞死區(qū)見大量的淋巴細胞，伴有肝細胞脂肪樣變；膠原纖維間隔增生明顯，膠原纖

13、維從門管區(qū)處往外延伸到鄰近門管區(qū)及肝小葉內。 3.2.3模型九周組：炎癥反應進一步加重，門管區(qū)、中央靜脈大量淋巴細胞浸潤，門管區(qū)間出現(xiàn)橋接壞死，肝小葉結構紊亂，部分中央靜脈變窄、偏位、缺如，門管區(qū)內纖維組織增生，出現(xiàn)粗大的纖維間隔，部分標本可見形成假小葉。 3.2.4纖維化形成統(tǒng)計：S0：(對照組10例)S1：(模型六周組4例)S2：(模型六周組14例；模型九周組5例)S3：(模型六周組1例；模型九周組9例)S4：(模型

14、九周組2例) 4肝纖維化分級與肝纖維化血清指標的相關性4.1Ⅳ型膠原值與肝纖維化分級呈正相關，相關系數(shù)R=0.572，p＜0.01，纖維化程度越高Ⅳ型膠原值越大。 4.2Ⅲ型前膠原值與肝纖維化分級呈正相關，相關系數(shù)R=0.910，p＜0.01，纖維化程度越高透明質酸值越大。 4.3透明質酸值與肝纖維化分級呈負相關，相關系數(shù)R=-0.574，p＜0.01，纖維化程度越高透明質酸值越小。 4.4層粘蛋白值與肝

15、纖維化分級無明顯相關性。相關系數(shù)R=0.087，p＞0.05。5膽囊病理觀察 5.1大體觀察：對照組膽囊壁表面光滑，血管稀疏，無擴張，膽汁較透明。實驗模型組膽囊壁表面有部分隆起，血管明顯增多，膽汁混濁。 5.2病理改變按慢性膽囊炎病理分級結果：(1)、模型六周組：輕度11例，中度例6例，無明顯改變2例。(2)、模型九周組：輕度3例，中度6例，重度7例。 結論：1本實驗表明豚鼠對TAA藥物毒性反應有很好的耐受性和易

16、感性，經(jīng)飲用水攝入TAA可以作為一種簡便、無創(chuàng)、經(jīng)濟、適宜的方法應用于豚鼠肝纖維化、肝硬化誘導過程。體重監(jiān)測是一種無創(chuàng)、安全、有效的監(jiān)測手段。 2PC-Ⅲ、Ⅳ-C血清水平與豚鼠肝纖維化發(fā)展程度有很好的相關性，PC-Ⅲ、Ⅳ-C水平可作為豚鼠肝纖維化血清評價指標。LN、HA血清水平與其他實驗及臨床結論相悖，需進一步研究。 3本實驗模型豚鼠肝纖維化病理變化及膽囊病理變化結果，初步表明誘導豚鼠肝纖維化過程中膽囊已出現(xiàn)早期病變，其