脯氨酰寡肽酶過(guò)表達(dá)對(duì)硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型影響.pdf

1、目的：探討慢病毒介導(dǎo)的脯氨酰寡肽酶（POP）過(guò)表達(dá)對(duì)硫代乙酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的影響。
　　方法：從基因庫(kù)中獲取大鼠POP基因序列（NM_031324），構(gòu)建攜帶POP基因慢病毒過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)酶切鑒定及測(cè)序的方式鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒，采用Western Blot的方法驗(yàn)證 POP蛋白在293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；以不同劑量的POP慢病毒載體（1.25×10^7TU、2.5×10^7TU和5×10^7TU）轉(zhuǎn)染正常大鼠，另設(shè)相應(yīng)濃度空病毒

2、載體對(duì)照（每組n=3，門靜脈注射病毒)，注射后2 w進(jìn)行肝臟取材，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同劑量慢病毒轉(zhuǎn)染后肝內(nèi)POP mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異；以慢病毒（5×10^7TU）轉(zhuǎn)染正常大鼠，分別于注射后1 w、2 w和3 w處死大鼠，用實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同時(shí)長(zhǎng)肝內(nèi)POP mRNA相對(duì)表達(dá)量變化。
　　40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，采用5％TAA腹腔內(nèi)注射誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，各組分別在造模第1w末門靜脈注射生理鹽水（正常對(duì)照組

3、和TAA模型組）、空病毒（空病毒組，TAA模型+空病毒組）或攜POP慢病毒（POP慢病毒組，TAA模型+POP慢病毒）；在造模第4w末，隔夜禁食后次日下腔靜脈取血，處死動(dòng)物，稱量肝臟濕重，留取肝臟組織；采用蘇木素-伊紅（HE）染色及Masson染色觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)及纖維化情況，采用化學(xué)比色法測(cè)定肝組織內(nèi)羥脯氨酸含量，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肝臟組織POP、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、α平滑肌骨動(dòng)蛋白（α-SMA）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β

4、（TGF-β）和Ⅰ型膠原（Co l-1）mRNA表達(dá)，采用Western Blot法檢測(cè)POP、CD68、α-SMA、TGF-β、磷酸化Smad-2蛋白表達(dá)水平，采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè) CD68(+)細(xì)胞數(shù)量和分布；采用自動(dòng)生化儀測(cè)定各組大鼠血清生化指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、血清白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBIL）。
　　結(jié)果：酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果均與目的基因吻合，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，W

5、estern Blot可在293T細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到Flag與目的基因融合蛋白；不同劑量的攜POP慢病毒或空病毒轉(zhuǎn)染大鼠2w后，與正常對(duì)照組比較，大鼠肝組織內(nèi)POP mRNA表達(dá)在1.25×10^7TU慢病毒組RQ值為0.96，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，2.5×10^7TU慢病毒載體組與5×10^7TU慢病毒載體組RQ值分別為1.38和1.3，均顯著高于對(duì)照組（P<0.01）,但2.5×10^7TU組與5×10^7TU組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；空病毒

6、載體與正常對(duì)照組間POP mRNA無(wú)顯著差異。冰凍切片觀察熒光與上述結(jié)果相符。
　　模型組POP蛋白相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著降低（P<0.05），而POP慢病毒組POP蛋白水平較其余三組均顯著升高(P<0.01)，POP mRNA相對(duì)表達(dá)變化與POP蛋白相一致；TAA模型組和空病毒組的纖維化評(píng)分多為Ⅱ級(jí)，肝纖維化半定量積分分別為(15.2±1.69)和（15.3±4.62），顯著高于正常對(duì)照組(1.75土0.63)和POP慢病毒

7、組(7.75±2.71)（P<0.05）；模型組和空病毒組肝組織羥脯氨酸含量分別為（504.47±111.15）μg/g肝質(zhì)量和（498.32±90.87）μg/g肝質(zhì)量，均顯著高于正常對(duì)照組【（298.20±47.47μg/g肝質(zhì)量），P<0.05】，而POP慢病毒組大鼠肝組織中羥脯氨酸含量為（383.52±43.49μg/g肝質(zhì)量），顯著低于模型組和空病毒組（P<0.05）；模型組及空病毒組α-SMA mRNA較正常對(duì)照組分別升高2

8、~3倍（P<0.01），蛋白水升高3~4倍（P<0.01），POP慢病毒組大鼠肝組織α-SMA mRNA和蛋白水平較模型組及空病毒組分別降低50%左右和30%~40%（P<0.05）；與對(duì)照組比較，模型組及空病毒組血清 AST【(167.21±41.41)U/L，(169.22±31.46) U/L】為對(duì)照組的1.4倍【(123.81±23.02) U/L，P均<0.05】，模型組及空病毒組的血清ALT【(62.79±10.80) U/

9、L，(59.8±15.85) U/L】、TBIL【（167.21±41.41）μmol/L，（169.22±31.46）μmo l/L】為對(duì)照組的1.7～3.4倍【（33.67±2.84）μmo l/L，（2.56±1.17）μmo l/L，P均<0.01】，ALB【（20.54±2.02）g/L，（20.19±2.00）g/L】較對(duì)照組下降約20%【（25.01±1.77）g/L，P<0.01】；POP慢病毒組AST、ALT和TBIL

10、分別為(127.89±32.7)U/L、(41.95±11.75)U/L和TBI(4.28±1.67)μmol/L，較模型組及空病毒組降低約30%~70%（P<0.05），ALB為(22.73±1.77)g/L，較正常對(duì)照組稍下降（P<0.05）；模型組及空病毒組較正常對(duì)照組 MCP-1 mRNA水平均升高4~5倍（P<0.01），POP慢病毒組大鼠肝組織MCP-1 mRNA水平較模型組及空病毒組降低50%~60%（P<0.05）；模型

11、組及空病毒組較正常對(duì)照組TGF-β mRNA升高6~8倍（P<0.01），蛋白水平均升高1~2倍（P<0.01），POP 慢病毒組大鼠肝組織TGF-βmRNA較模型組及空病毒組降低40%~50%，蛋白水平降低40%（P<0.05）；模型組及空病毒組較正常對(duì)照組Smad2/3蛋白水平均升高1~2倍（P<0.01），POP慢病毒組大鼠肝組織Smad2/3蛋白水平較模型組及空病毒組降低40%~50%（P<0.05）；模型組CD68陽(yáng)

12、性細(xì)胞數(shù)為（52.75±21.639）/HP，空病毒組為（54±1.19.5）/HP，均顯著高于正常對(duì)照組【（2.66±1.15），P<0.01】，而POP慢病毒組為（21±13.45）/HP，較模型組及空病毒組均顯著減少（P<0.01）。
　　結(jié)論：構(gòu)建成功的攜POP基因慢病毒能成功在大鼠肝臟內(nèi)實(shí)現(xiàn)POP蛋白的持續(xù)過(guò)表達(dá)；POP肝內(nèi)過(guò)表達(dá)能抑制TAA誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的進(jìn)展，這一過(guò)程中伴隨著肝內(nèi)MCP-1等炎癥反因細(xì)胞因子表達(dá)抑