核因子-κB在硫代乙酰胺所致比格犬肝纖維化中的表達(dá)變化及意義.pdf

1、研究背景：
　　核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一個廣泛存在于機體多種細(xì)胞胞漿的重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，常以無活性的形式存在，在免疫和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、凋亡調(diào)控及腫瘤形成等方面起到關(guān)鍵作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)：NF-κB可能通過調(diào)控肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）、枯否細(xì)胞（kupffer cell，KC）的活化、增殖參與肝纖維化的形成與發(fā)展。導(dǎo)師課題組前期通過在體及體外

2、實驗研究均表明：NF-κB信號通路參與了肝纖維化的形成過程。
　　動物模型的建立可為人類疾病的發(fā)病機制，預(yù)防和治療的研究提供一定的實驗理論依據(jù)。以往肝纖維化動物模型多以小哺乳動物大鼠、小鼠等為主要研究對象，這對于我們理解疾病的病理生理過程有著非常重要的價值。實驗研究終歸還是要為臨床服務(wù)，在應(yīng)用于臨床之前，須有大動物的實驗研究為基礎(chǔ)。實驗用大動物有獼猴、犬、小型豬等，犬類較獼猴等非人靈長類動物而言，較易取得，價格相對較低；小型豬主要

3、用于復(fù)制心血管疾病的相關(guān)模型。用于醫(yī)學(xué)研究的犬主要有比格犬、墨西哥無毛犬、四系雜交犬等。比格犬具有遺傳性穩(wěn)定、性情溫順、易于馴服和抓捕、給藥方便、對藥物比較敏感且個體差異較小等優(yōu)點，因此本課題選擇比格犬作為研究對象。
　　硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）是一種肝毒性化學(xué)物質(zhì)，有弱致癌作用。采用TAA皮下注射法可以成功誘導(dǎo)小動物肝纖維化模型，該造模方法應(yīng)用于小動物的研究，技術(shù)已比較成熟，模型制備成功率較高，而且所造動

4、物模型在基本病理學(xué)、血液生化的改變等方面接近于與人類肝纖維化的病程發(fā)展，但其是否能誘導(dǎo)大動物比格犬肝纖維化模型呢？NF-κB信號通路是否參與該過程呢？目前國內(nèi)外文獻(xiàn)少見報道，為此我們進(jìn)行了本課題。
　　目的：
　　明確TAA是否能成功誘導(dǎo)比格犬肝纖維化模型，并探討其作用機制是否與NF-κB信號通路有關(guān)。
　　方法：
　　選用健康清潔級雄性比格犬12只，8月齡，體重（10±1）kg，隨機分為兩組后采用耳標(biāo)法標(biāo)記編號

5、以便于區(qū)分：
　　正常對照組：6只，自由飼養(yǎng)12周；
　　TAA組：6只，TAA皮下注射，12mg/kg，2次/周，持續(xù)12周。
　　12周末所有比格犬禁食8h后,采用1.5％戊巴比妥鈉靜脈麻醉，取出各組比格犬相同部位的肝組織，將所取肝組織浸泡于10％中性福爾馬林進(jìn)行固定,梯度酒精脫水（由低到高濃度）后石蠟包埋，肝組織切片行HE染色和Masson三色染色，觀察比格犬肝組織的病理組織學(xué)變化及肝內(nèi)膠原纖維的形成情況；免疫組

6、織化學(xué)染色法檢測比格犬肝組織中NF-κB p65、α-SMA和CollagenⅠ的表達(dá)部位及分布情況。
　　結(jié)果：
　　1.HE染色結(jié)果：正常對照組比格犬肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞沿中央靜脈周圍呈條索狀排列，肝細(xì)胞輪廓圓潤，核仁飽滿，無變性壞死；TAA組可見比格犬肝組織中肝細(xì)胞變性壞死，大量的炎性細(xì)胞浸潤，肝索正常結(jié)構(gòu)消失，纖維條索形成。
　　2.Masson三色染色結(jié)果：正常對照組僅在比格犬肝組織中小葉間動、靜脈

7、和膽管壁及中央靜脈管壁周圍可見到少量細(xì)絲狀的膠原纖維；TAA組比格犬肝內(nèi)膠原纖維明顯增生，且向肝小葉內(nèi)延伸，有形成假小葉的趨勢。
　　3.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：
　　陽性結(jié)果判定：比格犬肝組織中出現(xiàn)棕黃色顆粒和（或）棕褐色顆粒為陽性著色。
　?。?）NF-κB p65的表達(dá)：正常對照組比格犬肝組織中棕黃色顆粒僅在中央靜脈周圍的個別肝細(xì)胞胞漿中見有表達(dá)；TAA組比格犬肝組織中棕褐色顆粒位于細(xì)胞漿及細(xì)胞核，細(xì)胞核多見，尤在

8、纖維間隔、匯管區(qū)部位及其周圍的肝細(xì)胞表達(dá)顯著；
　?。?）α-SMA的表達(dá)：正常對照組僅分布于比格犬肝組織的血管壁，染色較淡；TAA組比格犬肝組織中纖維間隔、中央靜脈、匯管區(qū)及肝竇中均有明顯棕黃色顆粒沉積，且著色較正常對照組深；
　?。?）CollagenⅠ的表達(dá)：正常對照組在比格犬肝組織中央靜脈、小葉間動、靜脈和膽管壁部位可見少量棕黃色顆粒，在肝實質(zhì)內(nèi)沿竇壁形成絲狀著色；TAA組比格犬肝組織中陽性表達(dá)明顯增強，在匯管區(qū)周圍

9、、纖維間隔區(qū)和肝竇內(nèi)表達(dá)顯著。
　　4.Masson三色染色圖像半定量結(jié)果分析：
　　膠原面積百分比比值經(jīng)平方根反正弦轉(zhuǎn)換后，正常對照組為1.54±0.11，TAA組為7.43±0.17。TAA組中膠原纖維的表達(dá)較正常對照組相比明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（1.54±0.11 vs7.43±0.17，P＜0.01）。
　　5.免疫組織化學(xué)染色圖像半定量結(jié)果分析：
　　各項指標(biāo)的IOD值統(tǒng)計結(jié)果如下：（1）NF-κB

10、 p65：正常對照組為0.16±0.03， TAA組為5.17±0.02；（2）α-SMA：正常對照組為0.56±0.03，TAA組為5.39±0.17；（3）CollagenⅠ：正常對照組為0.15±0.01，TAA組為4.41±0.11。，TAA組中的NF-κB p65、α-SMA和CollagenⅠ的表達(dá)較正常對照組相比均顯著性增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（0.16±0.03 vs5.17±0.02，P＜0.01；0.56±0.03 v