ZEB-1在大鼠肝纖維化模型和肝星狀細(xì)胞中的動態(tài)表達(dá)及意義.pdf

1、目的：
　　 中國是一個(gè)肝病大國，各種病因?qū)е碌母窝住⒏螕p傷可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌，該病治療效果差，病死率高，給病人及其家庭帶來了大的負(fù)擔(dān)，而肝纖維化(Hepatic fibrosis)是其病情發(fā)展必經(jīng)階段，近來學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)早期肝纖維化經(jīng)過治療是可以發(fā)生逆轉(zhuǎn)的，這對阻斷肝炎、肝硬化、肝癌一系列發(fā)展無疑是個(gè)好消息，于是阻斷早期肝纖維化的發(fā)展甚至逆轉(zhuǎn)早期病變對臨床肝病的治療顯得尤為重要。ZEB-1是二鋅指蛋白家族的其中一個(gè)

2、成員，很早就有報(bào)道顯示它作為細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子參與著TGF-β通路的調(diào)控，而TGF-β1是肝纖維化發(fā)生發(fā)展和誘導(dǎo)HSC活化最關(guān)鍵的細(xì)胞因子，由此該研究旨在通過觀察ZEB-1在大鼠肝纖維化模型及肝星狀細(xì)胞經(jīng)TGF-β1刺激后的動態(tài)變化來初步探討它對大鼠肝纖維化的影響。
　　 方法：
　　 健康雄性SD大鼠60只，分為健康對照組8只和模型組52只，模型組按造模后不同時(shí)間點(diǎn)分為2周，4周，6周，8周四個(gè)亞組。所有大鼠均在清潔環(huán)境下

3、，采用王寶恩造模法模型組0.2ml/100g劑量經(jīng)腹腔注射二甲基亞硝胺(DMN)，每周前三天每天一次，持續(xù)4周建立纖維化模型，常規(guī)喂養(yǎng)至8周末，每到時(shí)間點(diǎn)后隨機(jī)處死6只，下腔靜脈取血后離心取上清，測定不同時(shí)間點(diǎn)ALT，AST的變化;肝組織經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片后經(jīng)HE，Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理變化;采用RT-PCR和Western blotting檢測不同時(shí)間點(diǎn)肝臟ZEB-1mRNA和蛋白的表達(dá)。大鼠HSCT-6

4、細(xì)胞用含10-12％胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)生長傳代，至3-4代對數(shù)生長期接板，濃度為1.8×105/L，加不同濃度TGF-β1因子刺激，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，48h后提取RNA及蛋白，檢測在不同TGF-β1濃度刺激下ZEB-1mRNA及蛋白的表達(dá)情況。各組間均數(shù)比較采用單因素分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.采用王寶恩方法成功誘導(dǎo)建立大鼠肝纖維化模型，4，6周時(shí)病理學(xué)圖片顯示肝內(nèi)出血壞死明顯，炎性細(xì)胞明顯增多，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞或

5、消失，藍(lán)色膠原纖維切割肝小葉形成假小葉。模型組血清ALT，AST在2周開始升高，4周達(dá)到最高峰(169.2±16.2，193.3±31.1)，明顯高于正常對照組(29.2±4.70，42.7±6.30)。
　　 2.RT-PCR結(jié)果顯示:ZEB-1mRNA在正常肝組織中少量表達(dá)，模型組表達(dá)逐漸升高，4周表達(dá)最高(3.177±0.046)，隨后6、8周又逐漸降低，各模型組與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=66.29，p＜0.05）

6、。TGF-β1的RNA表達(dá)情況與ZEB-1大致相同，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，4周值最高(2.729±0.039)，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=-222.27，p＜0.05)。
　　 3.western blotting結(jié)果顯示:ZEB-1和TGF-β1的表達(dá)情況與RNA類似，呈現(xiàn)先升高后降低的動態(tài)趨勢，在4周時(shí)表達(dá)量最高(2.533±0.379，1.881±0.185)。
　　 4，直線相關(guān)分析結(jié)果顯示:肝組織各模型組Z

7、EB-1mRNA及蛋白表達(dá)水平與TGF-β1表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.833，p＜0.05;0.674，p＜0.01)5、HSC-T6細(xì)胞中，ZEB-1在未經(jīng)處理的標(biāo)本中低表達(dá)，用5ng/L TGF-β1刺激后ZEB-1mRNA及蛋白表達(dá)較對照組增加(4.271±0.116，0.721±0.037)，10ng/L TGF-β1刺激后ZEB-1的表達(dá)較5ng/L的刺激濃度更高(4.737±0.107，1.036±0.045)，各組與對照組

8、相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=92.64，F(xiàn)=306.790，p＜0.05)。western blotting顯示α-SMA的表達(dá)隨著刺激濃度的增加而增加，各刺激組與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=136.45，p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.ZEB-1在大鼠肝纖維化模型中呈動態(tài)變化，隨著造模的延續(xù)，肝纖維化程度加深，表達(dá)逐漸升高，隨著染毒的停止，肝臟一定程度內(nèi)進(jìn)行自身修復(fù)后，表達(dá)有下降趨勢，與致肝纖維化主要因子

9、TGF-β1變化相一致，說明ZEB-1可能是隨著肝纖維化的程度增加它的表達(dá)也在不斷增加，從而進(jìn)一步激活TGF-β信號通路，加劇纖維化的進(jìn)展。
　　 2.用TGF-β1刺激HSC-T6細(xì)胞后，TGF-β1對HSC產(chǎn)生了一定程度的影響，使HSC活化的主要標(biāo)志α-SMA隨著刺激濃度的增加表達(dá)逐漸升高。ZEB-1在正常對照組呈低濃度表達(dá)，隨著刺激濃度的增加表達(dá)逐漸升高，說明TGF-β1的刺激可通過某些機(jī)制使ZEB-1的表達(dá)反饋性的升高，