SATB1在肝星狀細(xì)胞活化和大鼠肝纖維化形成中作用機(jī)制的研究.pdf

1、【研究背景與目的】
　　肝星狀細(xì)胞活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。既往研究表明，TGF-β1和MAPK信號通路的異常激活與肝星狀細(xì)胞活化及肝纖維化發(fā)展密切相關(guān)。SATB1是一種核基質(zhì)結(jié)合蛋白，調(diào)控超過1000種基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)；其參與介導(dǎo)TGF-β1及MAPK等重要細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并影響細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)過程。但目前關(guān)于SATB1在肝星狀細(xì)胞活化及肝纖維化形成中的作用尚無研究報道。因此，我們擬在體外細(xì)胞水平研究SATB1對肝

2、星狀細(xì)胞活化、增殖、遷移和粘附的影響及其機(jī)制，以及在體內(nèi)動物水平研究SATB1對大鼠肝纖維化形成的影響，探索SATB1在肝星狀細(xì)胞活化及肝纖維化形成中的作用及機(jī)制。
　　【方法】
　　利用硫代乙酰胺建立肝纖維化大鼠模型；免疫組織化學(xué)、激光共聚焦、real-time PCR和Western blot檢測正常及纖維化大鼠肝組織中SATB1和α-SMA的表達(dá)定位及含量變化。建立大鼠肝星狀細(xì)胞活化體內(nèi)及體外模型，real-time

3、PCR和Western blot檢測SATB1和α-SMA的表達(dá)變化。利用siRNA及SATB1真核表達(dá)質(zhì)粒（或SATB1腺病毒表達(dá)載體）建立SATB1低表達(dá)和過表達(dá)肝星狀細(xì)胞株（人肝星狀細(xì)胞株LX-2和大鼠HSCs）。Real-time PCR和Western blot法檢測SATB1表達(dá)變化對HSCs活化相關(guān)因子α-SMA、CTGF、COL1A1、COL3A1的影響。CCK-8及real-time PCR法檢測SATB1表達(dá)變化對L

4、X-2細(xì)胞增殖能力及cyclin D1、cyclin E1的影響。Transwell細(xì)胞遷移小室及細(xì)胞粘附實驗檢測SATB1表達(dá)變化對LX-2細(xì)胞遷移和粘附能力的影響。Real-time PCR和Western blot法初步篩選SATB1可能影響的細(xì)胞信號通路，包括：TGF-β1信號通路（TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7）、MAPK信號通路（Ras、Raf-1、MEK、ERK、JNK、P38）以及轉(zhuǎn)錄因子（

5、Smad4和Ets-1）。利用信號通路抑制劑Manumycin A（Ras）、GW5074（Raf-1）、U0126和PD98059（MEK/ERK）以及Ets-1 siRNA處理LX-2細(xì)胞(NC和siSATB1-1)，進(jìn)一步驗證SATB1調(diào)控CTGF的信號通路。Real-time PCR法檢測Ras GTP酶激活蛋白表達(dá)變化，篩選SATB1調(diào)控Ras激活的基因。硫代乙酰胺法建立肝纖維化大鼠模型，造模5周后將SATB1重組腺病毒經(jīng)尾靜

6、脈導(dǎo)入大鼠體內(nèi)，造模7周后HE、Masson及Sirius Red染色觀察肝組織病理改變及膠原沉積，測定肝功能（ALT和AST）評估肝損傷程度，測定羥輔氨酸評估肝內(nèi)膠原含量變化；免疫組化、real-time PCR及Western blot法檢測α-SMA、CTGF、COL1A1的表達(dá)定位及含量變化。
　　【結(jié)果】
　　SATB1在肝星狀細(xì)胞中表達(dá)并定位于細(xì)胞核；在肝星狀細(xì)胞體內(nèi)及體外活化過程中，隨著肝星狀細(xì)胞活化程度的增加

7、，其表達(dá)下降（p<0.05）。抑制SATB1表達(dá)可上調(diào)HSCs活化相關(guān)基因α-SMA、CTGF、COL1A1（p<0.05），促進(jìn)LX-2細(xì)胞增殖并上調(diào)cyclinE1，以及促進(jìn)LX-2細(xì)胞遷移（p<0.05）。反之，增強SATB1表達(dá)則發(fā)揮與上述相反的作用（p<0.05）。SATB1表達(dá)變化對LX-2細(xì)胞粘附能力無明顯影響（p>0.05）。抑制SATB1表達(dá)，對TGF-β1信號通路中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4及S

8、mad7的mRNA水平，以及Smad3磷酸化和Smad4核轉(zhuǎn)位無明顯影響；但可激活Ras，繼而誘導(dǎo)Raf-1向胞膜聚集，提高M(jìn)EK、ERK以及 Ets-1磷酸化水平。反之，增強 SATB1表達(dá)則顯著抑制Ras/Raf/MEK/ERK/Ets-1信號通路。此外，用Ras、Raf-1、MEK、ERK通路蛋白抑制劑和Ets-1 siRNA處理LX-2-siSATB1-1細(xì)胞，可有效抑制過度激活的Ras、Raf-1、MEK、ERK、Ets-1，

9、從而減弱或消除由SATB1下調(diào)所引起的CTGF表達(dá)上調(diào)。在動物實驗中，與PBS組和AdGFP導(dǎo)入組相比，AdSATB1導(dǎo)入組大鼠肝組織中纖維間隔及匯管區(qū)內(nèi)膠原沉積明顯減少，羥輔氨酸含量降低，肝功能有所改善，α-SMA、CTGF和COL1A1的表達(dá)水平不同程度下降（p<0.05）。
　　【結(jié)論】
　　在活化的肝星狀細(xì)胞中，SATB1表達(dá)水平下降； SATB1下調(diào)后激活Ras/Raf/MEK/EKR/Ets-1信號通路，誘導(dǎo)促纖