肝細(xì)胞SATB1表達(dá)在HBV相關(guān)肝纖維化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒感染是一個全球性健康問題。慢性HBV感染是肝硬化的重要病因，致使肝硬化成為我國常見疾病和導(dǎo)致死亡的主要原因之一。肝纖維化是慢性肝病向肝硬化進(jìn)展的中間環(huán)節(jié)。臨床上目前HBV相關(guān)肝纖維化的治療方法非常有限。因此，探索HBV相關(guān)肝纖維化的分子機(jī)制可能為慢性乙型肝炎肝硬化的治療提供潛在靶點(diǎn)。SATB1是一種組織特異性表達(dá)的核基質(zhì)結(jié)合蛋白，主要在胸腺細(xì)胞中表達(dá)，通過染色質(zhì)重塑調(diào)控基因的表達(dá)。SATB1在T細(xì)胞發(fā)育和活化，以及腫瘤

2、細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移等方面起到重要作用。本研究擬探索SATB1在HBV相關(guān)性肝纖維化中的作用及機(jī)制。
　　方法：采用免疫組織化學(xué)方法檢測58例患者慢性乙型肝炎肝組織和正常肝組織中SATB1的定位及表達(dá)情況。建立CCl4誘導(dǎo)的HBV轉(zhuǎn)基因鼠肝纖維化模型，使用real-time PCR、western blot、免疫組織化學(xué)檢測正常和不同程度纖維化小鼠肝組織中SATB1及肝星狀細(xì)胞活化指標(biāo)α-SMA的表達(dá)。肝細(xì)胞株L02分別瞬時轉(zhuǎn)染七種HBV

3、編碼基因真核表達(dá)質(zhì)粒及空載體后，real-time PCR檢測L02細(xì)胞中SATB1的表達(dá)，從而篩選調(diào)控SATB1表達(dá)的HBV編碼基因片段。構(gòu)建并鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)HBx的肝細(xì)胞株，使用real-time PCR、western blot、熒光素酶報(bào)告基因檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)HBx及空載體的肝細(xì)胞中SATB1的表達(dá)水平。使用不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的抑制劑（ERK抑制劑U0126；p38 MAPK抑制劑SB203580；JNK抑制劑SP600125；PI3K抑制劑L

4、Y294002）及對照DMSO處理穩(wěn)轉(zhuǎn)HBx肝細(xì)胞，以阻斷細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，real-time PCR和western blot篩選HBx可能調(diào)控SATB1表達(dá)的信號通路。在穩(wěn)轉(zhuǎn)HBx肝細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染SATB1啟動子區(qū)域可能結(jié)合的核轉(zhuǎn)錄因子siRNA， real-time PCR、western blot和熒光素酶報(bào)告基因檢測核轉(zhuǎn)錄因子SP-1、AP-1、NF-κB和SATB1的表達(dá)情況。過表達(dá)SATB1的肝細(xì)胞上清孵育肝星狀細(xì)胞，

5、采用real-time PCR、western blot、細(xì)胞免疫熒光、CCK8和Edu分別檢測肝星狀細(xì)胞活化水平和增殖能力的變化。采用蛋白芯片篩選過表達(dá)SATB1和對照的肝細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的含量及表達(dá)差異，然后添加細(xì)胞因子中和抗體到肝細(xì)胞上清和LX-2共孵育體系中，再次檢測肝星狀細(xì)胞活化水平和增殖能力的變化。最后，利用CCl4誘導(dǎo)的HBV轉(zhuǎn)基因鼠肝纖維化模型聯(lián)合尾靜脈注射SATB1干擾腺病毒，通過real-time PCR、west

6、ern blot、免疫組織化學(xué)等方法闡明SATB1參與HBV相關(guān)性肝纖維化形成的作用及機(jī)制。
　　結(jié)果：我們首先在58例肝組織中通過免疫組化技術(shù)證實(shí)SATB1與HBV相關(guān)性肝纖維化臨床病理密切相關(guān)，且 SATB1陽性主要在肝細(xì)胞胞核表達(dá)。然后使用四氯化碳誘導(dǎo)的 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠纖維化模型和 HBx穩(wěn)轉(zhuǎn)肝細(xì)胞系，從體內(nèi)和體外水平證實(shí)HBx上調(diào)SATB1表達(dá)，且ERK和 JNK信號通路在其中發(fā)揮作用。分離原代肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和使用細(xì)

7、胞株 L02、LX-2，通過共敷育肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)SATB1誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)促HSCs活化的細(xì)胞因子激活HSCs。在高表達(dá)SATB1肝細(xì)胞上清中，結(jié)合Elisa和蛋白芯片我們篩選出促纖維化因子IL-6,PDGF-AA，CTGF。抑制SATB1后，在穩(wěn)轉(zhuǎn)HBx肝細(xì)胞上清中，細(xì)胞因子IL-6，CTGF分泌減少。添加相應(yīng)細(xì)胞因子中和抗體，我們證實(shí)IL-6,PDGF-AA，CTGF在SATB1促HSCs增殖和活化中發(fā)揮作用。在HBV轉(zhuǎn)