TNFAIP8L2在肝纖維化中的作用及機(jī)制探討.pdf

1、目的：
　　TIPE2(TNFAIP8L2)即腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8型2，與TIPE1(TNFAIP8L1，TNF-α-induced protein8-like1)、TIPE（TNFAIP8）、TIPE3（TNFAIP8L3）同為腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8家族(TNFAIP8)成員，結(jié)構(gòu)上具有一定的同源序列。作為一個新型的抑炎分子，TIPE2在抑制炎癥反應(yīng)、維持機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。
　　本課題利用CC

2、l4誘導(dǎo)TIPE2敲基因（TIPE2-/-）小鼠與野生型C57小鼠建立肝纖維化動物模型，對比研究TIPE2在肝纖維化中的作用，進(jìn)而利用TGF-β1刺激肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞，研究TIPE2調(diào)控肝纖維化的分子機(jī)制，并探討TIPE2調(diào)控肝纖維化的細(xì)胞信號通路，以期明確TIPE2在該疾病中的作用并揭示其機(jī)制，為闡明該疾病的發(fā)生機(jī)制及臨床利用免疫調(diào)控分子干預(yù)治療該疾病奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究TIPE2

3、在肝纖維化模型中的作用
　　1.1 建立肝纖維化模型
　　取6-8周的C57雄性小鼠，將其隨機(jī)分為兩組，模型組(n=20)每周兩次腹腔注射給藥（20％四氯化碳溶液，每g體重注射5μl），對照組(n=20)每周兩次腹腔注射給藥（橄欖油，每g體重注射5μl）。在第四周時(shí)，眼球取血4000r/min離心10分鐘后取上清，用流式細(xì)胞儀檢測小鼠血清中MCP-1、TNF-α與IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)水平，用酶標(biāo)儀與分光光度計(jì)檢測AST與

4、ALT的表達(dá)，ELISA方法檢測TGF-β1的表達(dá)。在第二周與第四周時(shí)，小鼠常規(guī)方法處死后PBS灌流，取一份新鮮肝組織留待分子生物學(xué)檢測，一份肝組織（經(jīng)福爾馬林固定）制備成病理切片后用HE染色、Masson染色的方法分析其膠原沉淀形成情況，并綜合判斷肝纖維化形成情況。
　　1.2 肝纖維化模型組織中TIPE2的表達(dá)檢測
　　上述肝組織切片以TIPE2(JinSiTe，1∶200)，α-actin(Abcam，1∶200)，T

5、GF-β1(Abcam，5μg/ml)為一抗; SP-9000(ZSGB-BIO)為二抗，免疫組化檢測TIPE2、α-actin、TGF-β的表達(dá)，新鮮肝組織用于western blot檢測TIPE2的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析TIPE2表達(dá)強(qiáng)度與肝纖維化程度之間的相關(guān)性。
　　1.3 利用TIPE2-/-小鼠誘導(dǎo)模型驗(yàn)證TIPE2在肝纖維化中的作用
　　取6-8周齡TIPE2-/-(n=10)小鼠，每周一次腹腔注射5％四氯化碳溶液（每

6、g體重注射10μl）誘導(dǎo)肝纖維化模型，并以野生型C57小鼠為對照。第四周時(shí)，眼球取血后離心獲得血清，檢測血清中的MCP-1、TNF-α與IL-6等細(xì)胞因子;小鼠常規(guī)方法處死后PBS灌流，將肝組織（經(jīng)福爾馬林固定）制備成病理切片后用Masson染色的方法分析其膠原沉淀形成情況。
　　1.4 生存率分析
　　取6-8周齡TIPE2-/-(n=10)小鼠與C57小鼠(n=10)，每周兩次腹腔注射給藥（20％四氯化碳溶液，每g體重注

7、射20μl），動態(tài)觀察其生活狀態(tài)，并記錄其體重變化及死亡情況，至12周時(shí)常規(guī)方法處死小鼠，繪制生存曲線。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)
　　2.1 LX-2細(xì)胞培養(yǎng)
　　人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞（廣州Jennio生物科技有限公司）培養(yǎng)于含10％血清的RIPA1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5％二氧化碳、濕潤空氣。
　　2.2 檢測TIPE2在LX-2細(xì)胞中的表達(dá)
　　將LX2鋪到6孔板中（4×105個細(xì)胞/孔）培

8、養(yǎng)14個小時(shí)后對LX2細(xì)胞進(jìn)行不同濃度、不同時(shí)間的TGF-β1刺激。以不同濃度(0，2.5，5，10，20 ng/ml)的TGF-β1刺激一定時(shí)間后，用western blotting與real-time PCR的方法分別在蛋白水平和mRNA水平檢測TIPE2的表達(dá)，篩選TGF-β1刺激TIPE2表達(dá)的最佳作用濃度，再以篩選出的最佳濃度(10ng/ml)的TGF-β1分別刺激0、12、24、48小時(shí)，檢測TIPE2表達(dá)以篩選TGF-β1

9、的刺激TIPE2表達(dá)的最佳作用時(shí)間。
　　2.3 在LX-2細(xì)胞中研究TIPE2調(diào)控肝纖維化的機(jī)制
　　將人LX-2培養(yǎng)于60 mm小皿中（1×106個細(xì)胞/皿），貼壁24 h后以Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染TIPE2表達(dá)質(zhì)粒pRK5-hTIPE2，通過用western blotting與real-time PCR的方法分別在蛋白水平和mRNA水平檢測α-actin與MMP-2的表達(dá)來驗(yàn)證TIPE2在正常情況下和T

10、GF-β1刺激情況下對肝纖維化的影響。為探討TIPE2在LX-2細(xì)胞中的機(jī)制，我們在正常表達(dá)TIPE2與過表達(dá)TIPE2的LX-2細(xì)胞中用TGF-β1刺激細(xì)胞，western blotting的方法檢測了Smad3、ERK、IκB與JNK的磷酸化水平。
　　2.4 研究TIPE2調(diào)控Smad信號通路是否依賴于Rac1
　　眾所周知，TIPE2是Rac1的抑制分子。為研究TIPE2調(diào)控Smad信號通路是否依賴于Rac1，我們利

11、用了Rac1抑制劑(NSC23766)檢測Smad3的活性。
　　結(jié)果：
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.1 肝纖維化小鼠模型中TIPE2表達(dá)顯著上調(diào)
　　用HE與Masson染色的方法分析肝纖維化情況，結(jié)果顯示，肝纖維化模型組中炎癥細(xì)胞浸潤明顯，肝組織內(nèi)膠原蛋白的沉積較正常對照小鼠的肝組織顯著升高，同時(shí)，促肝纖維化分子α-actin顯著升高、抑纖維化分子MMP-2顯著下降，炎癥因子（MCP-1、TNF-α與IL-

12、6）顯著升高。以上結(jié)果說明肝纖維化動物模型誘導(dǎo)成功。用免疫組化與western blotting的方法檢測了肝纖維化模型肝組織中TIPE2的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化模型中TIPE2表達(dá)顯著上調(diào)，并且TIPE2表達(dá)強(qiáng)度與肝纖維化程度之間呈現(xiàn)正相關(guān)。此結(jié)果說明TIPE2在肝纖維化形成中發(fā)揮重要作用。
　　1.2 TIPE2基因缺失加重肝纖維化
　　用Masson染色的方法對比分析C57與TIPE2-/-小鼠模型中的肝纖維化程度

13、，結(jié)果顯示，TIPE2基因缺失后肝纖維化動物模型中肝臟的炎癥明顯較野生型小鼠模型嚴(yán)重，膠原蛋白的沉積亦明顯高于C57小鼠。用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測到TIPE2基因缺失模型小鼠中血清細(xì)胞因子水平（MCP-1與TNF-α）也顯著高于C57模型小鼠，此結(jié)果說明TIPE2在肝纖維化形成中發(fā)揮保護(hù)作用。
　　1.3 TIPE2基因缺失降低小鼠的生存率
　　同時(shí)給TIPE2-/-小鼠與C57小鼠腹腔注射同等劑量的四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化形成，

14、對比分析二者的生存率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C57小鼠生存率顯著高于TIPE2-/-小鼠。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　2.1 TIPE2在TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中顯著上調(diào)
　　我們用western blotting與real-time PCR的方法檢測TIPE2在LX-2細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LX-2細(xì)胞中TIPE2在TGF-β1存在時(shí)表達(dá)顯著上調(diào)，且具有時(shí)間依賴性與濃度依賴性。
　　2.2 TIPE2在TGF-

15、β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中下調(diào)α-actin、上調(diào)MMP-2
　　通過用western blotting與real-time PCR的方法分別在蛋白水平和mRNA水平檢測α-actin與MMP-2的表達(dá)來研究TIPE2在該疾病中的調(diào)控機(jī)制，結(jié)果顯示，在過表達(dá)TIPE2的LX-2細(xì)胞中，經(jīng)TGF-β1刺激后α-actin顯著下調(diào)、MMP-2顯著上調(diào)。
　　2.3 TIPE2抑制LX-2細(xì)胞的Smad3、IκB與JNK信號通路

16、r>　　Smad信號通路與NF-κB信號通路在該疾病中具有重要的作用。為探討TIPE2在肝纖維化中的調(diào)控機(jī)制，我們用western blotting的方法檢測TIPE2過表達(dá)的LX2細(xì)胞的Smad3、ERK、IκB與JNK的磷酸化水平。結(jié)果顯示，在過表達(dá)TIPE2的LX-2細(xì)胞中，經(jīng)TGF-β1刺激后Smad3、IκB與JNK的磷酸化水平顯著下調(diào)。
　　2.4 TIPE2調(diào)控Smad信號通路依賴于Rac1
　　TIPE2可以

17、通過與Rac結(jié)合抑制NF-κB、MAPK細(xì)胞信號通路，為探討在肝纖維化中TIPE2是否依賴于Rac1調(diào)控Smad信號通路，我們在轉(zhuǎn)染了TIPE2的LX-2細(xì)胞中加入Rac1抑制劑，利用western blotting的方法檢測Smad3的磷酸化水平，結(jié)果顯示，TIPE2對Smad3磷酸化水平的抑制作用可以被Rac1抑制劑阻斷。
　　結(jié)論：
　　1.TIPE2在肝纖維化中發(fā)揮保護(hù)作用。
　　2.TIPE2通過Rac1依賴