Nrf2及齊墩果酸在酒精性肝纖維化中的作用機制研究.pdf

1、核因子相關因子-2(Nrf2)是肝臟細胞防御氧化應激的重要調(diào)節(jié)因子，通過介導一系列抗氧化酶和2相解毒酶的表達，降低各種藥物、毒素、化學致癌物等有害物質(zhì)肝毒性。酒精是引起氧化應激常見損害因素之一，酒精性肝纖維化是臨床常見病，部分病人戒酒后并不能完全阻止肝纖維化進展。齊墩果酸是一種傳統(tǒng)護肝藥物，主要成分五環(huán)三萜類化合物，可從多種中藥中提取，其保肝作用具體分子生物學機制尚不明確。國外有研究證明人工合成三萜類化合物對Nrf2-keap通路有顯著

2、激活作用。本研究旨在觀察Nrf2在小鼠酒精性肝纖維化(ALF)中表達情況，探討齊墩果酸抗纖維化作用分子生物學機制，為ALF的預防和治療提供新的思路。
　　 目的：⑴觀察通過酒精灌胃的方法建立昆明種小鼠肝纖維化模型情況。并檢測肝纖維化小鼠血清ALT、AST及TBIL水平及總結肝組織病理改變特點。⑵觀察核因子相關因子-2(NF-E2-related Factor2，Nrf2)在小鼠酒精性肝纖維化(alcoholic liver fi

3、brosis，ALF)表達情況。⑶觀察齊墩果酸對正常小鼠及飲酒小鼠肝細胞Nrf2表達情況。⑷觀察齊墩果酸預處理能否減輕肝細胞炎癥侵潤、改善肝細胞損傷，預防或減緩纖維化進程，探討抗纖維化分子生物學機制。⑸觀察齊墩果酸對正常小鼠及飲酒小鼠肝細胞增殖及凋亡影響。⑹研究酒精對小鼠單核巨噬細胞激活情況，為下一步探索其在肝纖維化進程中作用機制奠定基礎。
　　 方法：30只昆明種健康雌性小鼠，正常飼養(yǎng)適應環(huán)境1周后，隨機分為4組：模型組(B組

4、)10只，通過50％酒精灌胃(gastric infusing，ig)建立小鼠酒精性肝纖維化動物模型；治療組(C組)10只，預先給予齊墩果酸灌胃進行干預，酒精灌胃方法同模型組；對照組：A1組5只，只應用生理鹽水灌胃作為對照。A2組5只，只應用齊墩果酸灌胃作為對照。四組均自由飲水和進食分籠喂養(yǎng)于20-25℃明暗各12小時的動物中心實驗室內(nèi)，分別于12周末以10％的水合氯醛(3-5ml/kg)腹腔注射麻醉處死(處死前隔夜禁食)。處死小鼠2小

5、時前，腹腔注射250mg/kg BrdU(標記增殖肝細胞)。采血途徑為心臟穿刺取血，離心后取血清，于-20℃保存。迅速收獲肝臟標本，3/4部分用10％的甲醛溶液固定，制作石蠟切片，1/4部分液氮快速冰凍后儲存于-80℃冰柜中，用于制備RNA懸液等。標本分批作如下檢測：①血清標本送檢臨床生化室，應用全自動生化分析儀檢測血清酶學指標ALT、AST及TBIL水平；②肝臟石蠟切片常規(guī)HE染色觀察各組小鼠肝臟組織病理學改變(炎細胞浸潤、肝實質(zhì)細胞

6、壞死分級情況參照Thompson[37]慢性肝損害評分標準)；MT染色評價纖維化情況，并應用圖像分析系統(tǒng)量化分析；③免疫組化及免疫熒光方法檢測Nrf2在對照組及模型組中表達情況及齊墩果酸預處理對酒精性肝纖維化小鼠Nrf2的表達影響；檢測各組小鼠細胞外基質(zhì)蛋白FN的表達；應用ER-MP23抗體(抗巨噬細胞凝集素特異性單克隆抗體)標記免疫熒光方法檢測巨噬細胞激活及侵潤情況。應用BrdU標記免疫組化方法檢測各組小鼠肝細胞增殖情況。應用TUNE

7、L(原位末端標記法)染色法檢測原位肝細胞凋亡情況。④肝臟冰凍標本送檢分子生物學實驗室，定量RT-PCR法檢測各組小鼠纖維化相關因子CollagenⅠα、TGF-β1、α-SMA mRNA的表達水平。
　　 結果：⑴A1及A2對照組小鼠ALT、AST及TBIL水平無顯著性差別(p>0.05)。模型組小鼠ALT、AST及TBIL水平較對照組均有顯著升高(p<0.05)。齊墩果酸治療組小鼠ALT、AST及TBIL水平較模型組有顯著下降

8、(p<0.05)。⑵HE染色結果：對照組A1及A2組小鼠肝小葉結構和匯管區(qū)、細胞形態(tài)均正常，未見明顯炎細胞侵潤。模型組小鼠肝細胞變性嚴重，見散在的多發(fā)灶狀甚至結節(jié)樣壞死，小葉中央?yún)^(qū)及匯管區(qū)見大量炎癥細胞浸潤，以單核細胞、淋巴細胞為主，并有一些中性粒細胞浸潤。治療組情況較模型組炎細胞浸潤及肝細胞壞死情況相對較輕。治療組與模型組炎細胞浸潤評分情況分別為1.90±0.74 vs2.70±0.95(p<0.05)：肝細胞損傷比較評分情況分別為1

9、.80±0.79 vs2.40±0.51(p<0.05)。 MT染色結果：對照組A1及A2組小鼠肝臟組織僅在血管周圍見極輕微纖維化(藍色部分)，且兩個對照組間無顯著差別。模型組小鼠肝組織匯管區(qū)及中央靜脈周圍見較多纖維組織分割，較寬，且相互連接、融合。治療組纖維化范圍較模型組明顯減小，且纖維分隔多纖細。形態(tài)學測量分析分別為1.86±1.23％VS3.55±1.37％(p<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。⑶Nrf2表達情況：A1及A2對照組小

10、鼠，Nrf2在極少數(shù)肝細胞胞漿中表達，且兩個對照組間無顯著差別；模型組小鼠肝細胞胞漿Nrf2表達明顯增強；治療組小鼠Nrf2在肝細胞胞漿中表達顯著強于模型組小鼠，分別為92.31±15.45VS69.31±12.18(p<0.01)。FN表達情況：A1及A2對照組小鼠極少量FN表達，兩個對照組間無顯著差別。模型組小鼠FN表達明顯增強。治療組小鼠FN的表達與模型組相比明顯減弱，分別為2.32±1.13％VS5.17±2.05％(p<0.0

11、5)。巨噬細胞免疫熒光染色：A1及A2對照組小鼠肝臟見極少數(shù)ER-MP23陽性細胞，且兩個對照組間無顯著差別。模型組與治療組小鼠ER-MP23陽性細胞數(shù)分別為(178±35個/mm2VS113±29)個/mm2，p<0.05)，治療組巨噬細胞數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義。原位肝細胞凋亡情況：A1及A2對照組小鼠僅見極少數(shù)肝細胞凋亡，且兩個對照組間無顯著差別。模型組與治療組小鼠凋亡細胞數(shù)分別為(232±45個/mm2VS209±27)個

12、/mm2，p>0.05)，治療組小鼠肝細胞凋亡有所減少，但差異無統(tǒng)計學意義。肝細胞增殖分析：A1及A2對照組小鼠僅見極少數(shù)BrdU陽性肝細胞(1.09±1.03％VS1.15±1.24％，p>0.01)，且兩個對照組間無顯著差別。模型組與治療組小鼠BrdU陽性細胞數(shù)分別為(2.35±1.21％VS2.75±1.06％，p>0.05)，治療組肝細胞增殖率較模型組略高，但差異無統(tǒng)計學意義。⑷四個組小鼠肝組織COL1α、TGF-β1及α-SM

13、AmRNA表達結果一致。A1及A2對照組小鼠肝臟組織幾乎未見COL1α、TGF-β1及α-SMAmRNA表達。模型組小鼠COL1α、TGF-β1及α-SMAmRNA表達水平明顯升高。齊墩果酸預處理組較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：①采用酒精灌胃方法12周可以成功建立小鼠ALF模型。該造模方法符合人類飲酒特點，簡便易行且成功率高，是一種有效的造模方法。②Nrf2在酒精性肝纖維化小鼠肝組織中表達增加，原因考慮肝細胞

14、對酒精引起氧化應激損傷產(chǎn)生保護性反應所致.齊墩果酸能增強飲酒小鼠肝臟Nrf2表達，但對正常小鼠肝臟Nrf2表達無影響。③齊墩果酸能顯著降低飲酒小鼠的血清ALT、AST、TBIL水平，減輕肝細胞的變性、壞死、炎細胞反應以及肝小葉纖維化。齊墩果酸對正常對照組小鼠血清ALT、AST、TBIL水平及COL1α、α-SMA、TGF-β1 mRNA表達并無影響。齊墩果酸對正常小鼠肝臟組織病理學無影響。其保肝及抗纖維化分子生物學機制可能是通過增強酒精

15、損傷肝細胞Nrf2表達，誘導下游抗氧化基因表達，保護肝細胞對抗氧化應激，減少巨噬細胞激活及侵潤，降低TGF-β1 mRNA的表達，阻止星形細胞的激活，下調(diào)COL1α的表達，減少細胞外基質(zhì)蛋白的合成與和蓄積而實現(xiàn)其抗纖維化作用的。④齊墩果酸對正常小鼠肝細胞增殖與凋亡無影響。但能在一定程度促進飲酒小鼠肝細胞增殖，并降低肝細胞凋亡率，但與模型組小鼠相比無顯著差別。肝細胞增殖與凋亡有多重機制參與，齊墩果酸可能僅對其中某方面機制有決定作用，故無法