Fas-FasL在酒精性肝炎-肝纖維化發(fā)病與進(jìn)展中作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是指由于長期大量飲酒而導(dǎo)致的肝臟損害，包括單純脂肪肝、酒精性肝炎及肝纖維化、肝硬化。酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)/酒精性肝纖維化(alcoholic liverfibrosis，ALF)是ALD病變過程的重要階段，以肝細(xì)胞脂肪變伴有壞死性炎癥為主要特征，進(jìn)一步導(dǎo)致肝硬化，并是肝細(xì)胞癌的致病因素之一。肝細(xì)胞凋亡是多種炎癥性肝損傷的病理表

2、現(xiàn)，其由多種細(xì)胞因子參與的外源性與內(nèi)源性凋亡信號通路激活致肝實質(zhì)細(xì)胞程序性死亡、進(jìn)而可誘發(fā)肝臟炎癥及纖維化。Fas/Fas配體(Fas Ligand，F(xiàn)asL)系統(tǒng)是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的主導(dǎo)基因調(diào)控系統(tǒng)之一，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)在非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)生及發(fā)展過程中起著重要的作用，但其在酒精性肝炎、肝纖維化發(fā)病及進(jìn)展中細(xì)胞凋亡的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，針對細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的靶基因調(diào)控藥物及基因治療措施亦亟待探討。本研

3、究旨在探明酒精性肝炎、肝纖維化中Fas/FasL系統(tǒng)及其下游相關(guān)基因表達(dá)的變化及其在該病進(jìn)展中的作用，以進(jìn)一步闡明酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制，為該病的治療提供新的途徑及科學(xué)依據(jù)。
　　方法：選用健康雄性C57BL/6J小鼠，分別采用含4％酒精Lieber-DeCarli液體飼料4周及聯(lián)合Lieber-DeCarli液體飼料與微量四氯化碳8周建立小鼠酒精性肝炎、酒精性肝纖維化模型，以等熱量麥芽糊精代替酒精喂養(yǎng)小鼠作為對照組。造模完成處死動

4、物，留取血清及肝組織標(biāo)本，部分肝組織用4％中性甲醛固定，其余肝組織以液氮快速冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｑ灞彼岚被D(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)及血清門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)采用日本Olympus AU2700全自動生化分析儀酶法測定。肝組織切片采用HE染色觀察肝脂肪變、炎癥活動及纖維化程度；Masson染色觀察肝纖維化程度。脫氧核糖核苷酸末端

5、轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediatednick end labeling，TUNEL)檢測肝細(xì)胞凋亡情況。分別采用RT-PCR、Western blot及免疫組織化學(xué)染色檢測肝組織Fas、FasL、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(cysteine aspartate-speci

6、fic proteases3，caspase3)及細(xì)胞色素P4502E1(Cytochrome P4502E1，CYP2E1)mRNA及蛋白表達(dá)。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，用最小顯著差-t(the least significant difference-t，LSD-t)檢驗進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：應(yīng)用含4%酒精Lieber-DeCarl

7、i液體飼料聯(lián)合微量四氯化碳腹腔注射可快速建立小鼠酒精性肝炎、肝纖維化模型，且造模方法簡單易行，動物死亡率低，模型穩(wěn)定性好，可作為酒精性肝纖維化研究的實驗支撐模型。肝細(xì)胞凋亡數(shù)隨肝臟炎癥及纖維化的加重而增高，并伴有凋亡相關(guān)基因表達(dá)增強，對照組、酒精性肝炎組、酒精性肝纖維化組小鼠凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平依次升高(P<0.05)。
　　1.實驗小鼠一般情況對照組小鼠毛發(fā)有光澤，體態(tài)活潑，飲食及大小便正常；酒精性肝炎組、酒精性肝纖維化組小鼠精

8、神不振，飲食量減少，皮膚彈性差，毛發(fā)稀疏。
　　2.實驗小鼠血清生化學(xué)改變隨造模時間延長，酒精性肝纖維化組小鼠血清ALT和AST水平顯著高于酒精性肝炎組及對照組(P<0.05)。
　　3.實驗小鼠肝組織病理學(xué)變化肝組織切片HE及Masson染色顯示，對照組小鼠肝組織病理學(xué)無明顯異常；Lieber-DeCarli酒精液體飼料喂養(yǎng)4周，可見輕～中度肝細(xì)胞大泡性脂肪變及肝細(xì)胞水樣變，小葉內(nèi)點、灶狀壞死伴炎細(xì)胞浸潤；喂養(yǎng)8周，點灶狀

9、肝細(xì)胞壞死及炎細(xì)胞浸潤加重，并可見片狀肝細(xì)胞壞死，竇周及中央靜脈周圍纖維組織沉積，匯管區(qū)擴(kuò)大，纖維組織向小葉內(nèi)延伸，形成橋接纖維化。
　　4.Fas/FasL系統(tǒng)及其下游相關(guān)基因在酒精性肝炎/肝纖維化發(fā)病及進(jìn)展中的表達(dá)變化酒精性肝纖維化組小鼠肝組織Fas、FasL、TNF-α、caspase3、CYP2E1 mRNA及蛋白表達(dá)呈一致趨勢，酒精性肝纖維化組顯著高于酒精性肝炎組及對照組。肝組織切片免疫組織化學(xué)染色顯示：FasL、TNF