慢性乙型肝炎肝纖維化非創(chuàng)傷性診斷及肝纖維化進展的機制研究.pdf

1、第一部分HBeAg陰性慢性乙型肝炎肝纖維化非創(chuàng)傷性診斷模型的建立和應用評價
　　目的:在HBeAg陰性的慢性乙型肝炎患者中建立基于常規(guī)實驗室指標的肝纖維化非創(chuàng)傷性診斷模型，并評價其診斷肝纖維化的價值，為肝纖維化臨床診斷和療效評價提供依據(jù)。
　　方法:將349例具有肝活檢的HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者隨機分為建模組(n=200)和驗證組(n=149)。在建模組中，采用Logistic回歸和受試者操作特征(ROC)曲線等方法建

2、立診斷模型預測顯著性肝纖維化（S2-S4）和早期肝硬化(S4)。在驗證組中，用ROC曲線等方法評價和比較該模型、APRI指數(shù)、Forns指數(shù)、S指數(shù)和FIB-4模型的診斷價值。
　　結果:在建模組中，將年齡、性別、凝血酶原時間、血小板計數(shù)、γ-谷氨酰轉移酶及膽固醇這6個指標聯(lián)合起來建立診斷模型。它能準確的預測HBeAg陰性的慢性乙型肝炎患者有無顯著性肝纖維化和早期肝硬化，建模組ROC曲線下面積分別達到0.856和0.956?；赗

3、OC曲線，預測有無顯著性肝纖維化時，取0.22為陰性界值，0.75為陽性界值;預測有無早期肝硬化時，取0.95為陰性界值，0.98為陽性界值，能達到較好的診斷效果。相應的在驗證組中，該模型預測有無顯著性肝纖維化和早期肝硬化的ROC曲線下面積分別為0.889和0.937，優(yōu)于其他國內外模型。使用建模組所得到的界值，可以準確的預測40.9％的HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者有無顯著性肝纖維化及91.3％的患者有無早期肝硬化。
　　結論:

4、該模型能夠準確的區(qū)分HBeAg陰性的慢性乙型肝炎患者有無顯著性肝纖維化及早期肝硬化，減少臨床實踐中肝活檢的需要，具有較好的臨床應用前景。
　　第二部分慢性乙型肝炎進展中的差異基因表達譜研究
　　目的:應用基因芯片技術檢測不同炎癥階段的慢性乙型肝炎患者肝組織的基因表達譜，篩選與慢性乙型肝炎炎癥進展相關的差異基因，對其進行生物信息學分析，探討慢性乙型肝炎進展相關的分子機制。
　　方法:收集189例不同炎癥階段(G0-G4)

5、的慢性乙型肝炎患者肝活檢組織，Trizol一步法抽提總RNA。采用1％瓊脂糖凝膠電泳和芯片實驗室(Lab-on-chip)檢測RNA質量。使用QIAGENRNeasyKit進一步純化總RNA和cRNA。采用人類全基因組微陣列AffymetrixU133Plus2.0GeneChip檢測，應用GeneSpring軟件對顯著差異基因、聚類、基因功能和信號通路進行分析。采用實時熒光定量PCR技術對其中5個差異基因的表達水平變化進行驗證和分析。

6、
　　結果:1％瓊脂糖凝膠電泳和Lab-on-chip電泳結果均提示抽提的總RNA質量高，無降解現(xiàn)象。實驗結果符合AffymetrixU133Plus2.0基因芯片質量控制標準，信號強度達到要求，檢測系統(tǒng)無異常，從而保證了雜交結果的可靠性。差異基因聚類分析結果顯示基因表達譜和病理學肝炎分級具有很好的相關性。將G1-G4組分別和G0組進行比較，共篩選出570個顯著差異基因（P＜0.05）。G4/G0組間差異倍數(shù)≥2的上調和下調基因共

7、212個，主要是3大類功能基因（炎癥和免疫反應相關的基因占40.68％，信號轉導相關基因和結構分子相關基因各占10.17％。信號通路分析結果顯示有120條信號通路顯著活化（P＜0.05），其中28條信號通路極顯著活化(P＜0.001)，包括自然殺傷細胞介導的毒性相關的信號通路、T細胞受體信號通路和B細胞受體信號通路等。生物信息學分析顯示Jak-STAT通路處于通路網(wǎng)絡的核心位置，而CXCL10、STAT1、CCR2、CXCR4等是信號通

8、路間關聯(lián)的關鍵基因。Real-timePCR驗證結果和基因芯片所得數(shù)據(jù)相一致。
　　結論:慢性乙型肝炎的發(fā)生和發(fā)展是一個復雜的病理過程，涉及諸多基因的表達變化，單一基因或信號通路不足以解釋其分子機制的全貌。采用基因芯片技術高通量、高效率的篩選炎癥進展過程中差異表達的基因，對這些基因進行系統(tǒng)的分析研究有助于闡明慢性乙型肝炎的發(fā)生機制、指導治療和評估預后。
　　第三部分視黃醇脫氫酶13(Rdh13)基因敲除對四氯化碳誘導的小鼠肝

9、纖維化的作用及其機制研究
　　目的:本研究采用RdhJ13基因敲除小鼠來研究Rdh13在四氯化碳誘導的肝纖維化過程中的作用及其機制。
　　方法:本研究所用的野生型和Rdh13基因敲除小鼠均為8-10周齡的129/Sv和C57BL/6雜交系小鼠。以四氯化碳誘導小鼠急性肝損傷和慢性肝損傷所致肝纖維化模型。檢測肝臟的組織學和肝纖維化的關鍵標志物。在四氯化碳損傷后不同時間點，應用Real-timePCR、WesternBlot和免疫

10、組化方法檢測小鼠肝組織肝星狀細胞活化標記α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、(Ⅰ)型膠原、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、血小板源性生長因子(PDGF)和一些細胞黏附分子（細胞間黏附分子-1，血管細胞間黏附分子-1和纖維連接蛋白）的表達情況。
　　結果:CC14急性肝損傷在野生型和Rdh13基因敲除小鼠都建立了一個促肝纖維化發(fā)生的環(huán)境，包括肝星狀細胞的激活，Ⅰ型膠原、TIMP-1、主要的

11、促纖維化分子(TGF-β1，PDGF)及細胞黏附分子(ICAM-1，VCAM-1，fibronectin)的表達上調。而且與Rdh13基因敲除小鼠相比，該反應在野生型小鼠中更劇烈。CC14慢性肝損傷后，野生型和Rdh13基因缺失小鼠肝纖維化模型均成功建立。但是，與Rdh13基因敲除小鼠相比，野生型小鼠的肝纖維化程度較高，與之相伴隨的是肝星狀細胞激活的數(shù)量和膠原沉積較多，TIMP-1、TGF-β1、PDGF及細胞黏附分子表達上調較多。