ROCK-Ⅰ在大鼠肝纖維化形成和肝星狀細胞遷移過程中作用機制的研究.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝硬化的共同病理基礎(chǔ)和必經(jīng)階段，是影響慢性肝病的重要環(huán)節(jié)，因此肝纖維化的預(yù)防、治療乃至逆轉(zhuǎn)是阻斷肝硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝纖維化也成為國內(nèi)外學(xué)者研究慢性肝病的焦點。我國是肝病高發(fā)國家，以慢性乙型、丙型病毒性肝炎最為常見，在目前尚無良好的抗病毒藥物的情況下，阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進程成為治療慢性肝病的重要對策。 肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)是肝纖維化形成過

2、程中的關(guān)鍵細胞成分，是肝內(nèi)細胞外間質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要細胞來源，因此抑制HSCs活化與增殖則成為阻止并逆轉(zhuǎn)肝纖維化的主要途徑之一。 細胞遷移是機體正常生長發(fā)育以及組織損傷、修復(fù)和炎癥反應(yīng)必不可缺的病理生理過程，在肝組織修復(fù)及肝纖維化形成過程中，損傷局部大量HSCs聚集可能與HSCs定向遷移有關(guān)。細胞遷移涉及到細胞骨架、細胞黏附相關(guān)的動態(tài)組裝和空間位置的變化。從細胞生物學(xué)相關(guān)研究結(jié)果來看，細

3、胞黏附、鋪展和遷移是一復(fù)雜且尚未完全闡明的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控的病理生理過程。 近年來，Rho/ROCK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種器官組織慢性炎性纖維化中的作用受到了日益廣泛的關(guān)注。有研究表明，選擇性阻斷該信號通路可以改善纖維化器官的進展和預(yù)后，但其在肝纖維化進程中的作用機制目前尚不清楚。目前，該信號通路選擇性抑制劑國內(nèi)外均能生產(chǎn)，如該研究達到預(yù)期效果，將為肝纖維化的治療提供一種新的選擇。 為此，我們從HSCs遷移著手，以R

4、OCK-I、磷酸化肌球蛋白結(jié)合亞單位(myosin binding subunit，MBS Thr-697)、α-SMA 為切入點，有機結(jié)合整體和離體實驗，研究了Rho/RDCK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在實驗性大鼠肝纖維化形成和大鼠HSCs 遷移過程中的作用。 實驗內(nèi)容主要包括以下3部分： 第一部分：大鼠肝纖維化組織ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697、α-SMA的動態(tài)表達 目的：探討ROCK-I、磷酸化MBS Th

5、r-697、α-SMA 蛋白及其mRNA在實驗性大鼠肝纖維化形成過程中的動態(tài)表達及肌動蛋白細胞骨架的變化。 方法：采用膽總管結(jié)扎(bile duct ligation，BDL)方法制備大鼠肝纖維化模型，將80只雄性Sprague Dawley 大鼠隨機分成假手術(shù)組和模型組。模型組分別于結(jié)扎后1wk、2wk、3wk、4wk麻醉動物，假手術(shù)組與4wk模型組同批麻醉。采用HE 及Masson三色染色確定模型建立情況；免疫組織化學(xué)、We

6、stern blot 與RT-PCR 方法研究ROCK-I、α-SMA 蛋白及其mRNA 在肝纖維化不同時期肝組織中的分布及含量的動態(tài)變化；采用Western blot 方法檢測ROCK-I底物—肌球蛋白磷酸酶結(jié)合亞單位第697位蘇氨酸(MBSThr-697)，的磷酸化水平，作為Rho/ROCK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化指標(biāo)；采用特異性熒光染色方法檢測肝纖維化不同時期肌動蛋白細胞骨架的變化。 結(jié)果：①隨著肝纖維化的發(fā)展，大鼠肝臟中ROC

7、K-I、α-SMA 陽性細胞明顯增多，主要分布在匯管區(qū)、纖維間隔及增生的膽管周圍細胞，造模1～4wk 大鼠肝組織ROCK-I(14.71％±4.01％、20.66％±2.34％、26.21％±1.74％、32.50％±2.55％)、α-SMA(13.62％±1.48％、23.25％±2.02％、27.92％±1.61％、33.69％±1.999％)的陽性面積顯著性高于正常組(5.35％±1.30％、6.22％±1.56％)，P<0.05

8、。②Westerrl blot 結(jié)果顯示，正常大鼠ROCK-I 蛋白表達水平較低，在肝纖維化發(fā)生早期即出現(xiàn)表達上調(diào)，至病變后期仍維持較高水平，模型組1～4wk 其表達分別較正常對照組增加0.83倍、1.14倍、1.96倍、2.33 倍，假手術(shù)組與對照組之間無明顯差異，P>0.05；磷酸化MBS Thr-697蛋白模型組1～4wk分別較正常對照組增加0.80倍、1.37倍、2.29倍和3.34倍，假手術(shù)組與對照組之間無明顯差異，P>0.0

9、5；α-SMA 蛋白模型組1～4wk分別較正常對照組增加0.48倍、0.87倍、1.49倍和2.10倍，假手術(shù)組與對照組之間無明顯差異，P>0.05。③RT-PCR 結(jié)果顯示，正常大鼠肝組織中有α-SMA基因表達，模型組第2天(264.69±30.28)即出現(xiàn)表達上調(diào)，至第21天(817.33±67.60)達高峰后有所下降，至模型后期(801.67±78.50)仍高于基礎(chǔ)表達(245.33±27.16)。ROCK-I電泳條帶的光密度掃描

10、顯示，正常大鼠肝組織中就有ROCK-I基因表達，在纖維化發(fā)生早期即出現(xiàn)明顯上調(diào)，至第14天(722.67±86.08)達高峰而后下降，至病變后期(第28天)(707.00±82.79)仍高于基礎(chǔ)表達(276.33±37.45)，并且與0c—SMlA表達呈顯著性正相關(guān)(r=0.718，P<0.05)。④用FITC 標(biāo)記的鬼筆毒環(huán)肽熒光染色，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，正常大鼠肝臟F-actin位于細胞周邊，可見少量肌動蛋白絲，隨著造模時間延

11、長，肝組織熒光信號增強。 結(jié)論：肝纖維化形成過程中，ROCK-I、磷酸化MBS Thr-697和α-SMA表達明顯增加，提示ROCK-I 在肝纖維化發(fā)生過程中不但有表達上調(diào)，而且有功能活化；ROCK-I mRNA 表達水平較α-SMA 提前達峰值，提示ROCK-I 可能通過誘導(dǎo)肌成纖維細胞表型形成而參與肝纖維化的發(fā)生；肝纖維化形成過程中，隨著造模時間延長，可見大鼠肝組織特異性熒光信號增強，細胞間規(guī)則網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，提示肝纖維化時肌

12、動蛋白大量增生，同時發(fā)生細胞骨架重組。 第二部分：ROCK-I抑制劑Y-27632 抑制大鼠肝星狀細胞黏附與遷移 目的：觀察Rho/ROCK 信號通路特異性阻斷劑Y-27632對大鼠HSCsROCK-I、磷酸化MBS Thr-697、α-SMA表達及HSCs 黏附、遷移和細胞骨架的影響，探討該信號通路在HSCs 黏附、遷移過程中的作用。 方法：應(yīng)用體外細胞培養(yǎng)技術(shù)，采用MTT法測定HSCs 增殖；甲苯胺藍染色法測

13、定HSCs 黏附率；Boyden小室跨膜遷移分析法測定HSCs遷移；FITC標(biāo)記鬼筆毒環(huán)肽測定HSCs 細胞骨架變化；Western blot 測定ROCK-I底物—磷酸化MBS Thr-697蛋白表達，作為Rho/ROCK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化指標(biāo)；采用RT-PCR．方法研究ROCK-I、α-SMA mRNA在HSCs不同干預(yù)組的變化。 結(jié)論：體外細胞培養(yǎng)研究表明，ROCK-I特異性抑制劑Y-27632 可以抑制LPA誘導(dǎo)的HSC

14、s增殖、黏附和遷移，在一定濃度范圍內(nèi)，呈明顯的劑量依賴性和時間依賴性；Y-27632可以抑制HSCs ROCK-I、α-SMA和p-MBS Thr-697的表達；特異性熒光檢測F-actin研究表明，ROCK-I特異性抑制劑Y-27632可部分預(yù)防和逆轉(zhuǎn)LPA誘導(dǎo)的HSCs骨架重組。 第三部分：法舒地爾對實驗性大鼠肝纖維化組織及肝星狀細胞遷移的抑制作用 目的：觀察ROCK-I 選擇性阻斷劑法舒地爾對大鼠肝纖維化組織ROC

15、K-I、α-SMA、磷酸化MBS Thr-697表達及HSCs 黏附、遷移和細胞骨架的影響。 方法：從動物、細胞實驗兩方面，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法測定肝組織ROCK-I、α-SMA表達；Western blot方法測定肝組織和HSCs ROCK-I、α-SMA、磷酸化MBS-Thr697表達；RT-PCR 方法測定肝組織和HSCsROCK-I、α-SMA mRNA表達；免疫細胞化學(xué)測定HSCs ROCK-I、α-SMA表達；特異性

16、熒光染色檢測細胞骨架變化。 結(jié)論：ROCK-I 選擇性阻斷劑法舒地爾可抑制BDL大鼠模型肝組織ROCK-I、p-MBSThr-697、α-SMA 轉(zhuǎn)錄及翻譯水平表達；體外細胞培養(yǎng)研究表明，阻斷劑法舒地爾可抑制LPA誘導(dǎo)的HSCs黏附和遷移，在一定濃度范圍內(nèi)呈明顯的時間依賴性，同時法舒地爾可抑制LPA誘導(dǎo)的HSCs表達ROCK-I、p-MBSThr-697、α-SMA；特異性熒光檢測F-actin研究表明，法舒地爾可部分抑制BDL