RhoA-ROCK和MAPKs信號(hào)通路在高爐誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞膠原合成中的作用.pdf

1、目的:隨著糖尿病(diabetes mellitus，DM)發(fā)病率的逐年上升，DM引起的肝臟病變的嚴(yán)重性也日益受到關(guān)注。糖尿病肝臟病變?cè)缙谥饕憩F(xiàn)為非酒精性脂肪肝，進(jìn)一步可發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化;肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells，HSCs)的活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，HSCs激活后，其表型向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)，膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其中又以Ⅰ型、Ⅲ型為主。目前糖尿病所

2、致肝纖維化的具體機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)體外高糖培養(yǎng)HSCs，觀察RhoA/ROCK和MAPKs信號(hào)通路對(duì)HSCs膠原合成的影響，探討糖尿病肝纖維化發(fā)生的可能機(jī)制，為糖尿肝臟病變的防治提供新的依據(jù)。
　　方法:通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)，臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行HSCs活力鑒定。選用2-5代HSCs，無(wú)血清1640培養(yǎng)基同步化2小時(shí)，將其隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組（NG:含5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖組(HG:含25

3、 mmol/L葡萄糖)、高滲透壓組（OSM:5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇）、HG+法舒地爾組(12.5 umol/L、25 umol/L、50 umol/L)，培養(yǎng)24小時(shí)后，測(cè)定培養(yǎng)基中羥脯氨酸(HYP)含量，估算膠原含量。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定Ⅰ型、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)。采用Western blot法測(cè)定HSCs磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶點(diǎn)亞單位1(p-MYPT1)水平，代表ROCK活性;細(xì)胞外信號(hào)調(diào)

4、節(jié)激酶(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK的磷酸化水平反應(yīng)MAPKs信號(hào)通路的激活狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1、高糖和法舒地爾對(duì)培養(yǎng)基中HYP含量的影響:與對(duì)照組相比，高糖組HYP含量顯著升高(17.55±0.80μg/ml vs.26.24±0.91μg/ml，P＜0.01);與高糖組比較，高糖中加入法舒地爾(12.5 umol/L、25 umol/L、50 umol/L)后，HYP含量呈濃度依

5、賴性的顯著減少(23.22±0.62μg/ml、21.58±1.16μg/ml、19.31±0.37μg/ml vs.26.24±0.91μg/ml,P＜0.01)。高滲透壓組HYP含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（17.24±0.67μg/ml vs.17.55±0.80μg/ml,P＞0.05）。
　　2、高糖和法舒地爾對(duì)Ⅰ型、Ⅲ型前膠原基因表達(dá)結(jié)果:高糖組Ⅰ型、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)(P＜0.01);與高糖組比較，

6、高糖中加入法舒地爾后(12.5 umol/L、25 umol/L、50 umol/L)，Ⅰ型、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)顯著減少(P＜0.01);高滲透壓組Ⅰ型、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果提示:高糖促進(jìn)了HSCs膠原合成，法舒地爾能夠抑制高糖誘導(dǎo)的膠原合成，高滲透壓對(duì)膠原的合成沒(méi)有影響。
　　3、高糖和法舒地爾對(duì)ROCK活性的影響:磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶點(diǎn)亞單位1（p-MYPT1），是ROCK

7、信號(hào)通路激活的標(biāo)志，反應(yīng)了ROCK的活性。與對(duì)照組比較，高糖組p-MYPT1水平顯著升高(P＜0.01);與高糖組比較，在高糖中加入法舒地爾(12.5 umol/L、25 umol/L、50 umol/L)后p-MYPT1水平顯著降低（P＜0.01）;高滲透壓組p-MYPT1水平較對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果提示:高糖能夠激活ROCK，高滲透壓對(duì)ROCK沒(méi)有影響，法舒地爾可以阻斷高糖誘導(dǎo)的ROCK的過(guò)度激活。
　　4、

8、高糖和法舒地爾對(duì)MAPKs通路的影響:MAPKs成員主要包括ERK1/2、JNK和p38MAPK，其磷酸化水平代表了各自的活性。與對(duì)照組相比，高糖組ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平顯著升高(P＜0.01);與高糖組比較，在高糖中加入法舒地爾(12.5 umol/L、25 umol/L、50umol/L)后，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平顯著地降低(P＜0.01);高滲透壓組ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平