RhoA-ROCK信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf

1、目的:糖尿病可引起非酒精性脂肪性肝病，如不加以干預(yù)，常進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化，目前糖尿病性肝纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活、轉(zhuǎn)分化是纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。我們通過(guò)在體外高糖條件下培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞，探討RhoA/ROCK通路在高糖刺激肝星狀細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)分化中的作用及ROCK對(duì)MAPKs通路的調(diào)控作用，旨在為臨床糖尿病肝纖維化提供新的治療靶點(diǎn)。
　　方法:購(gòu)買

2、SD大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6進(jìn)行體外培養(yǎng)并用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化2h，實(shí)驗(yàn)設(shè)為對(duì)照組（NG:含5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖組(HG:含25 mmol/L葡萄糖)、高滲透壓組（HOSM:5.5 mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇）、HG+法舒地爾組（12.5、25、50μmol/L）。應(yīng)用MTS法測(cè)定肝星狀細(xì)胞的增殖;免疫細(xì)胞化學(xué)染色測(cè)定α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表達(dá)程度

3、;應(yīng)用Western blot方法分別檢測(cè)肌球蛋白磷酸酯酶靶點(diǎn)亞單位1(MYPT1)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38 MAPK的磷酸化水平及總蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、高糖和法舒地爾對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖的影響
　　從MTS結(jié)果可知:對(duì)照組的吸光度值為1.491±0.058，高糖組的吸光度為1.866±0.083，較對(duì)照組增加了20.1％(P＜0.01);HG+法舒地爾(1

4、2.5、25、50μmol/L)組的吸光度分別為1.783±0.018、1.736±0.052、1.572±0.039，與高糖組相比分別降低了4.4％、7％和15.8％(P＜0.01)，三實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖受抑制程度也有差異(P＜0.01);高滲透壓組的吸光度為1.513±0.084，與對(duì)照組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。這些結(jié)果提示:高糖可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞增殖，應(yīng)用法舒地爾能夠濃度依賴性地抑制高糖誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞增殖，單純高滲透

5、壓狀態(tài)對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有影響。
　　2、高糖和法舒地爾對(duì)肝星狀細(xì)胞內(nèi)α-SMA合成的影響
　　通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法觀察肝星狀細(xì)胞中α-SMA的陽(yáng)性表達(dá)率。在染色陽(yáng)性的細(xì)胞內(nèi)可見胞核呈空泡狀，核周胞漿處有黃褐色至棕褐色顆粒呈片狀分布。對(duì)照組可見少量細(xì)胞微弱表達(dá)α-SMA，平均陽(yáng)性表達(dá)率為11±0.540_％，高滲透壓組為13±0.852％，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);高糖組的細(xì)胞染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，α-SMA陽(yáng)性表達(dá)率為

6、31±0.332％，明顯高于對(duì)照組(P＜0.01);在高糖中加入不同濃度的法舒地爾，其α-SMA較單純高糖組均明顯下降（P＜0.01），且呈濃度依賴性（三實(shí)驗(yàn)組相比P＜0.01）。結(jié)果提示:正常糖濃度和單純高滲透壓條件下，肝星狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，僅微弱表達(dá)α-SMA，而高糖可以將肝星狀細(xì)胞激活并轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞大量合成α-SMA，應(yīng)用法舒地爾能濃度依賴性的抑制高糖誘導(dǎo)的α-SMA的合成。
　　3、高糖和法舒地爾對(duì)ROCK通路的

7、影響
　　MYPT1是ROCK通路的重要底物，它的磷酸化標(biāo)志著ROCK通路的激活，通常應(yīng)用MYPT1磷酸化的水平來(lái)反應(yīng)ROCK通路的活化程度。Western blot結(jié)果顯示高滲透壓組MYPT1磷酸化水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);高糖組MYPT1磷酸化水平較對(duì)照組明顯增高（P＜0.01），在高糖中加入不同濃度法舒地爾，MYPT1磷酸化水平較單純高糖組明顯下降（P＜0.01）。結(jié)果提示:高糖能夠激活ROCK通路，

8、高滲透壓對(duì)ROCK通路沒(méi)有影響，法舒地爾可以阻斷高糖誘導(dǎo)的ROCK通路過(guò)度激活。
　　4、高糖和法舒地爾對(duì)MAPKs通路的影響
　　MAPKs主要包括ERK1/2、JNK和p38MAPK，各通路活性均以磷酸化水平表示。Western blot結(jié)果示:與對(duì)照組相比，高滲透壓對(duì)ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平無(wú)明顯影響(P＞0.05)，而高糖刺激顯著地增加了ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平(P＜0.01)，在