RhoA-BKCa-ROCK通路在模擬失重大鼠動脈重建中的作用.pdf

1、航天失重可導(dǎo)致機體產(chǎn)生一系列飛行后心血管失調(diào)（postflight cardiovascular dysfunction,PFCD）現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為飛行后立位耐力不良（postflight orthostatic intolerance,POI）及運動能力下降，對人類航天活動及航天員返回地面1 G重力環(huán)境后的再適應(yīng)能力均造成嚴(yán)重影響。微重力環(huán)境暴露所致 POI的發(fā)生機理十分復(fù)雜，雖經(jīng)多年研究仍未完全闡明，因此，目前仍無有效的對抗措施。已

2、有工作證實，失重/模擬失重所致動脈血管的區(qū)域特異性重建，尤其是腦動脈收縮功能增強所導(dǎo)致的腦血管血流量降低以及外周阻力血管收縮功能減弱所導(dǎo)致的血管總外周阻力（total peripheral resistance, TPR）下降，可能是導(dǎo)致POI發(fā)生的主要機制之一。因此，研究失重/模擬失重條件下機體動脈結(jié)構(gòu)和功能的區(qū)域特異性重建對于闡明POI的發(fā)生機理并提出具有針對性的對抗措施均有重要意義。
　　前期研究表明，多種機制可能共同參與失

3、重/模擬失重所致動脈結(jié)構(gòu)與功能重建的調(diào)節(jié)，包括血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）離子通道重塑、局部腎素-血管緊張素（local renin-angiotensin system, L-RAS）系統(tǒng)、活性氧（reactive oxygen spices,ROS）、一氧化氮-一氧化氮合酶（nitric oxide-nitric oxide synthase,NO-NOS）通路以及炎性反應(yīng)等

4、。大量血管生物學(xué)研究證實，RhoA-Rho激酶（Rho kinase, Rho-associated coiled-coil forming kinase,ROCK）通路在上述各機制的調(diào)節(jié)中均發(fā)揮了重要作用。RhoA是Rho蛋白家族成員之一，除調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架的作用外，還參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞收縮、運動、增殖和凋亡等。ROCK即Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶，是研究最為廣泛的RhoA下游效應(yīng)分子，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。目

5、前，有關(guān) RhoA-ROCK通路在高血壓、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病血管收縮反應(yīng)異常中的調(diào)節(jié)作用已得到廣泛證實，且我們的前期研究亦初步證實ROCK在模擬失重大鼠大動脈收縮功能改變中可能發(fā)揮重要作用，因此，我們推測，RhoA-ROCK通路可能作為核心環(huán)節(jié)，協(xié)調(diào)上述多種可能參與失重/模擬失重所致動脈重建的通路機制，共同介導(dǎo)模擬失重大鼠動脈血管尤其是阻力血管結(jié)構(gòu)與功能重建的發(fā)生。
　　本研究采用28天尾部懸吊（hindlimb unw

6、eighted,HU）模擬失重大鼠模型模擬失重對大鼠心血管系統(tǒng)的影響，以股動脈（femoral artery,FA）、基底動脈（basilar artery,BA）和腸系膜3級小動脈（third-order mesenteric artery,MA）為研究對象，分別檢測其受體和非受體介導(dǎo)的動脈收縮功能改變及RhoA-ROCK通路在其中發(fā)揮的作用。同時，我們進一步深入研究RhoA/BKCa通道之間的結(jié)構(gòu)和功能聯(lián)系及其在模擬失重所致動脈功能

7、重建中的作用機制。最后，我們初步探討Caveolae/RhoA/BKCa三者之間共定位結(jié)合并組成VSMCs表面緩沖系統(tǒng)（buffering system）從而代償外界應(yīng)力改變的可能性。
　　本研究主要結(jié)果如下：
　?。?）HU顯著降低大鼠股動脈中ROCK的表達并抑制其活性
　?、倥c對照組（control,CON）大鼠相比，HU大鼠FA中苯腎上腺素（phenylephrine,PE）和氯化鉀（potassium chlo

8、ride,KCl）誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)均顯著降低。
　　②應(yīng)用ROCK特異性抑制劑Y-27632可同等程度抑制CON和HU大鼠FA收縮功能。
　?、跦U顯著降低FA中ROCK II的表達及肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphatase,MLCP）、肌球蛋白輕鏈（myosin light chain,MLC）的磷酸化水平，并顯著增強p65核轉(zhuǎn)位及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible NOS,iNO

9、S）的表達。
　?、蹾U顯著增加FA組織中NO的產(chǎn)量，且Y-27632可顯著放大該效應(yīng)。
　?。?）RhoA-ROCK通路在模擬失重大鼠腦動脈、腸系膜小動脈等阻力血管收縮功能改變中可能發(fā)揮代償性保護作用
　　①與CON大鼠相比，PE、五羥色胺（serotonin,5-HT）及KCl誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)在HU大鼠BA中均顯著增強，在MA中均顯著降低。
　?、诔?-HT誘導(dǎo)的CON大鼠BA收縮功能外，Y-27632可顯著抑

10、制兩組大鼠BA和 MA的收縮反應(yīng)，且與CON大鼠相比，Y-27632對HU大鼠BA收縮功能的抑制程度顯著降低，而對MA的抑制程度則顯著增強。
　?、踄-27632顯著增強5-HT誘導(dǎo)的CON大鼠BA的收縮反應(yīng)。
　?、芘cCON大鼠相比，U-46619介導(dǎo)的收縮反應(yīng)在HU大鼠BA中顯著降低，而在MA中顯著增強。⑤HU導(dǎo)致RhoA-ROCK通路蛋白表達及活性在BA和MA中發(fā)生不同程度的變化，具體表現(xiàn)為，在BA中 RhoA、ROC

11、K的表達不變但活性降低，而在MA中二者的表達及活性均顯著增強。
　?。?）RhoA/BKCa復(fù)合體可能作為緩沖系統(tǒng)共同代償模擬失重所致阻力動脈收縮功能重建
　?、倥cCON大鼠相比，BKCa通道α和β亞基蛋白表達在HU大鼠BA中顯著增強，在MA中未見顯著改變。
　　②免疫共沉淀結(jié)果顯示，當(dāng)以RhoA作為目標(biāo)分子進行靶向捕獲時，可在大鼠BA中同時檢測到BKCa通道α和β亞基的表達，而在MA中僅檢測到β亞基的表達，且HU顯著

12、上調(diào)上述BKCa通道亞基蛋白的表達水平。
　?、郛?dāng)以BKCa通道β亞基作為靶分子進行捕獲時，在大鼠BA和MA中均可檢測到RhoA的表達，且HU亦顯著增強兩種動脈組織中RhoA的表達水平。
　?、芗す夤簿劢箤嶒炦M一步證實上述結(jié)果，與CON大鼠相比，HU大鼠BA和MA中RhoA與BKCa通道α/β亞基之間的融合熒光顯著增強，且更加規(guī)則并更加趨近于細(xì)胞膜和細(xì)胞兩極。
　?、菰隗w外構(gòu)建的BKCa通道過表達HEK293T細(xì)胞模型

13、中亦發(fā)現(xiàn)，以RhoA或BKCa通道β亞基作為目標(biāo)分子進行靶向捕獲時，均可檢測到對方的表達，且僅在β亞基存在的情況下，才能檢測到α亞基的表達。
　?、奕?xì)胞膜片鉗結(jié)果表明，使用選擇性 RhoA抑制劑肉毒桿菌C3外酵素（Clostridium botulitum C3 exoenzyme,C3）可顯著增強BKCa通道電流密度，而 RhoA激動劑U-46619則顯著抑制 BKCa通道電流密度。
　?、逪U顯著降低大鼠主動脈VSMC

14、s中小窩結(jié)構(gòu)（Caveolae）的數(shù)量，但并未影響其結(jié)構(gòu)蛋白Caveolin-1（Cav-1）的表達。
　?、喈?dāng)以Cav-1作為靶分子進行捕獲時，可在大鼠胸主動脈（thoracic aorta,TA）和腹主動脈（abdominal aorta,AA）中同時檢測到RhoA及BKCa通道α/β亞基的表達，且HU可顯著降低兩種主動脈中RhoA的共定位表達。在TA中，HU亦顯著降低α亞基的共定位表達而顯著增強β亞基的表達。相反，在AA中，

15、HU可顯著增強α亞基的表達而顯著降低β亞基的表達。
　　以上結(jié)果表明：
　　1）28天模擬失重顯著降低 ROCK的表達及其對下游靶通路的作用，包括與股動脈收縮反應(yīng)性直接相關(guān)的MLCP/MLC通路，以及間接相關(guān)的NF-κB/iNOS/NO通路，二者可能共同導(dǎo)致模擬失重大鼠股動脈收縮功能降低；
　　2）RhoA與BKCa通道之間存在共定位結(jié)合關(guān)系，且模擬失重可能通過改變二者之間結(jié)合方式以及結(jié)合程度的形式代償大鼠阻力動脈功能