上調(diào)PPAR-γ表達(dá)抑制肝星狀細(xì)胞活化及肝纖維化.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝硬化發(fā)展的必由之路，肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells，HSC)的細(xì)胞質(zhì)中儲存了人體80％的維甲酸，當(dāng)出現(xiàn)刺激因素時，HSC失去維生素A脂滴被活化，成為平滑肌肌動蛋白-α(α-smooth muscle actinα-SMA)陽性的肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts MFB)。這是產(chǎn)生肝臟膠原和形成肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。
　　 過氧化物酶體增生因子激活受

2、體(Peroxisomeproliferator-activated receptor PPAR)是一種新的固醇類激素受體，包括(α，γ和δ/β)。對肝星狀細(xì)胞而言PPAR-γ在脂肪形成過程中起關(guān)鍵作用，可能影響HSC儲存維甲酸的能力。
　　 本課題中我們通過感染PPAR-γ慢病毒載體，上調(diào)活化HSCs及大鼠肝纖維化模型體內(nèi)PPAR-γ表達(dá)，檢測活化HSCs的α-SMA，Ⅰ-型膠原表達(dá)及細(xì)胞增殖；檢測大鼠肝纖維化模型體內(nèi)α-SM

3、A，Ⅰ-型膠原及羥脯氨酸的表達(dá)，肝纖維化程度，以探索PPAR-γ蛋白表達(dá)上升對大鼠HSC活化和增殖的影響以及是否可減輕大鼠肝纖維化。研究分4部分。
　　 第一部分：采用Ⅳ型膠原酶肝臟灌注消化及Nycodenz密度梯度離心等方法體外成功分離、純化及培養(yǎng)了HSC。
　　 第二部分：將大鼠PPAR-γ基因序列進(jìn)行PCR擴增，與pGC-FU-3FLAG載體定向連接，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞。對長出的克隆先進(jìn)行菌落PCR鑒定，再對

4、PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測序和比對分析。構(gòu)建好的融合蛋白表達(dá)慢病毒載體感染293T細(xì)胞，觀察熒光蛋白表達(dá)及Western blot檢測融合蛋白表達(dá)，測定病毒滴度。
　　 結(jié)果顯示成功構(gòu)建大鼠PPAR-γ基因慢病毒表達(dá)載體pGC-fu-3flag-PPAR-γ，載體表達(dá)正常，濃縮慢病毒懸液的滴度為2E+8 TU/ml。
　　 第三部分：將體外培養(yǎng)活化HSC分成3組：空白對照組(C)、慢病毒載體對照組(NC)和PPAR-γ過

5、表達(dá)組(PPAR-γ)，分別以病毒增強劑、無效慢病毒載體和pGC-fu-3flag-PPARγ慢病毒載體處理，然后行相關(guān)檢測。
　　 結(jié)果：pGC-fu-3flag-PPAR-γ感染HSC上調(diào)PPAR-γ表達(dá)，可顯著抑制活化HSC中α-SMA以及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)以及HSC增殖(P<0.01，PPAR-γ vs.C，NC)。α-SMA蛋白表達(dá)-C組1648.544±350.85，NC組1279.45±223.85，PPAR-γ組5

6、28.94±77.77；Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)-C組1055.99±346.97，NC組1309.1±603.82，PPAR-γ組87.17±85.15；HSC增殖自第三天起出現(xiàn)顯著差異，C組202.5±6.66％，NC組208.33±6.59％，PPAR-γ組161.5±3.02％。所以上調(diào)PPAR-γ表達(dá)可抑制大鼠HSC的活化和增殖。
　　 第四部分：將SD大鼠隨機分為早期肝纖維化組(2周組)和持續(xù)肝纖維化組(8周組)，每一時間組

7、又分為4組：正常對照組(C)、肝纖維化組(F)、空白病毒載體組(N)、PPAR-γ感染組(P)。以50％CCl4(CCl4：植物油=1:1)0.15ml/100g對F、N、P組進(jìn)行腹腔注射，同時給于10％酒精口服，以同樣劑量的植物油代替CCl4對C組進(jìn)行腹腔注射，每周2次，分別按組別注射2周和8周。然后將0.5ml含5E+7TU/ml PPAR-γ基因慢病毒表達(dá)載體的病毒稀釋液以門靜脈注射的方法注入P組大鼠體內(nèi)上調(diào)PPAR-γ基因表達(dá)，

8、N組注入0.5ml含5E+7TU/ml空白質(zhì)粒的病毒稀釋液，其余2組注入同樣劑量病毒稀釋液，注射結(jié)束2周后處死，對肝組織行相關(guān)檢測。
　　 結(jié)果：①早期肝纖維化組上調(diào)PPAR-γ基因表達(dá)可部分抑制α-SMA的表達(dá)(P>0.05，P2vs.C2 and N2；P<0.05，P2vs.F2)，α-SMA蛋白表達(dá)-F2組818.32±235.51，N2組782.85±213.75，P2組586.05±206.66，C2組390.96±

9、111.93；而對羥脯氨酸量和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)無顯著性抑制(P>0.05，P2vs.F2，N2；P<0.01，P2vs.C2)，羥脯氨酸量表達(dá)(μg/g蛋白)-F2組299.4±26.3，N2組287.7±30.5，P2組288.8±32.6，C2組227.5±13.8(P>0.05，P2vs.F2，N2；P<0.01，P2vs.C2)。Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)-F2組988.52±328.65，N2組1003.29±415.6，P2組904.

10、47±337.5，C2組602.28±206.04；各組肝纖維化程度亦無顯著差異。②持續(xù)肝纖維化組上調(diào)PPAR-γ基因表達(dá)可顯著抑制α-SMA、羥脯氨酸及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)(P<0.01，P8vs.F8，N8，P>0.05，P8vs.C8)，α-SMA蛋白表達(dá)-F8組1147.27±424.77，N8組1088.8±346.35，P8組598.01±151.49，C8組447.23±137.92；羥脯氨酸量表達(dá)(μg/g蛋白)-F8組48

11、8.7±36.5，N8組447.5±73.86，P8組391±32.37，C8組254±17.3。Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)-F8組1204.07±287.90，N8組1101.4±232.89，P8組844.89±225.51，C8組621.06±235.63；肝臟病理SSS評分P8組4.16±0.51，F(xiàn)8組6.36±0.58，N8組7.63±1.12(P<0.01，P8.vs.F8，N8)。所以提高肝內(nèi)PPAR-γ基因的表達(dá)能一定程度上減輕