新型重組人內(nèi)皮抑素聯(lián)合順鉑的抗血管形成作用和機(jī)制的研究.pdf

1、Folkman在1971年提出了腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于血管形成的學(xué)說(shuō),這意味著阻斷血管形成可以作為一種有效的腫瘤治療策略。目前,抗血管形成治療已經(jīng)在臨床上取得了很大的成功。血管形成抑制劑分為間接和直接兩種類型,前者干擾腫瘤和血管成分之間的聯(lián)系,后者“靶向”腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs),阻止ECs對(duì)多種促血管形成因子的反應(yīng)。由于血管ECs不容易發(fā)生突變而產(chǎn)生耐藥,它對(duì)抗血管形成治療能夠維持較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。

2、 Folkman實(shí)驗(yàn)室的O'Reilly等于1997年在鼠血管外皮細(xì)胞瘤的培養(yǎng)基中鑒定出內(nèi)皮抑素(Endostatin,ES),它是膠原ⅩⅧ羧基末端一個(gè)20kDa的蛋白水解片斷,具有潛在的抑制血管形成活性。恩度(Endostar,YH-16)是新型重組人內(nèi)皮抑素,它在ES的氨基末端修飾了9個(gè)氨基酸,從而改善了產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性。在Ⅲ、Ⅳ期臨床研究中,恩度與化療聯(lián)合使用,顯著地提高了腫瘤治療的有效率,延長(zhǎng)了晚期非小細(xì)胞肺癌(NSC

3、LC)的中位腫瘤進(jìn)展時(shí)間(TTP),且聯(lián)合用藥時(shí)程與生存期獲益呈正相關(guān)。中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)于2005年批準(zhǔn)了恩度聯(lián)合NP方案治療國(guó)人晚期NCSLC的適應(yīng)癥。但是,這種新型血管形成抑制劑與化療聯(lián)合使用的抗腫瘤作用和機(jī)制的深入研究未見報(bào)道。 ES通過(guò)多種非特異性的ECs膜受體發(fā)揮作用,也能調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白酶活性。Abdollahi等發(fā)現(xiàn)ES調(diào)節(jié)了血管ECs中12％人類基因組基因的表達(dá),并顯著下調(diào)多個(gè)促血管形成信號(hào)通

4、路。所以,當(dāng)ES與其它藥物聯(lián)合使用時(shí),有可能產(chǎn)生交互作用。另一方面,細(xì)胞毒藥物也具有非特異性的抗血管形成作用,它在很大的治療窗內(nèi)能抑制微血管ECs的增殖和遷徙。但是,腫瘤局部的促血管形成因子能夠誘導(dǎo)和促使ECs抗拒細(xì)胞毒藥物的作用。因此,將化療藥物與血管形成抑制劑聯(lián)合使用,有可能克服促血管形成因子對(duì)血管ECs的保護(hù)作用,產(chǎn)生協(xié)同的抗血管形成效應(yīng)。 順鉑(cisplatin,CDDP)是一種重要的抗癌藥物,它也能抑制微血管ECs的

5、增殖,并誘導(dǎo)其凋亡。本研究擬揭示恩度的抗血管形成活性特點(diǎn),考察恩度和順鉑聯(lián)合使用的協(xié)同抗血管形成作用,并分析兩藥聯(lián)合使用的增效機(jī)制。這些研究對(duì)于挖掘恩度潛在的抗腫瘤活性、選擇合適的藥物治療方式以及鑒定抗血管形成治療的新“靶點(diǎn)”具有重要意義。 方法： 為了揭示恩度和順鉑聯(lián)合使用對(duì)血管形成的影響,首先使用MTS/PMS系統(tǒng)(改良的MTT法)考察恩度與順鉑單藥抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilicalvein end

6、othelial cells,HUVECs)、肝癌細(xì)胞系QGY-7701和SMMC-7721增值的劑量-效應(yīng)關(guān)系,以選擇合適的藥物濃度進(jìn)行聯(lián)合用藥研究。在上述三種細(xì)胞上,以增值抑制分析、克隆形成分析和凋亡誘導(dǎo)分析,考察恩度與順鉑聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞生物學(xué)活性的影響,評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥抑制細(xì)胞增殖和存活的協(xié)同作用,以及這種作用與細(xì)胞類型的關(guān)系。其后,在HUVECs體外培養(yǎng)體系上,以遷徙/侵襲分析和管道形成實(shí)驗(yàn),考察兩藥聯(lián)合使用的抗血管形成潛能,分析聯(lián)

7、合用藥方式的協(xié)同抗血管形成作用。最后,以雞胚尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)模型,揭示恩度抑制新生血管形成的活性特點(diǎn),驗(yàn)證聯(lián)合用藥方式的抗血管形成療效。 為了揭示聯(lián)合用藥產(chǎn)生增效作用的分子機(jī)制,以Agilent人類全基因組寡核苷酸DNA芯片展示恩度、順鉑以及兩藥聯(lián)合干預(yù)HUVECs的早期基因表達(dá)譜。在數(shù)據(jù)歸一化后,選取那些在聯(lián)合用藥時(shí)被顯著調(diào)節(jié)的基因,這些基因表達(dá)的變化與對(duì)照組比

8、較差異在2倍以上,并且其表達(dá)被同向調(diào)節(jié)的程度超過(guò)了單藥水平。在對(duì)參與血管形成作用的基因進(jìn)行功能群分類后,從中過(guò)濾出血管形成相關(guān)基因。此后,進(jìn)一步挑選出調(diào)節(jié)血管形成的重要基因,這些基因的表達(dá)在聯(lián)合用藥時(shí)被同向調(diào)節(jié)的程度較單藥大2倍以上。為了獨(dú)立驗(yàn)證基因芯片結(jié)果,選擇6個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證,在評(píng)價(jià)了陣列資料的可靠性后,探討這些重要基因的改變?cè)诼?lián)合用藥時(shí)發(fā)揮增效作用的分子機(jī)制。 結(jié)果： 1.在50～300ng

9、/ml的劑量范圍內(nèi),恩度具有抑制HUVECs增殖的作用,隨著劑量增大至200ng/ml以上,增殖抑制率在達(dá)到28.8％后趨于穩(wěn)定。順鉑在1～32μM的劑量范圍內(nèi)能有效地抑制HUVECs增殖,其細(xì)胞毒活性呈現(xiàn)劑量依賴性。 2.恩度(200ng/ml)和順鉑(8μM)具有抑制HUVECs增殖和克隆形成的活性,并能誘導(dǎo)HUVECs凋亡,兩藥聯(lián)合具有協(xié)同的抑制作用,并增強(qiáng)了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。上述作用具有血管ECs特異性,兩種肝癌細(xì)胞系未表現(xiàn)

10、出這種特點(diǎn)。 3.恩度(200ng/ml)與順鉑(8μM)具有抑制HUVECs遷徙/侵襲和管道形成的功能,聯(lián)合用藥產(chǎn)生了協(xié)同的抗血管形成作用,與單藥比較有顯著性差異(P<0.05)。 4.CAM分析表明,恩度在50～400ng/ml的劑量范圍內(nèi)能顯著地抑制新生血管形成,但劑量-效應(yīng)之間并無(wú)線性關(guān)系,其中,對(duì)血管形成的抑制作用在低劑量組間沒有顯著性差異,但在劑量達(dá)到400ng/ml時(shí),其抑制作用與低劑量組比較卻顯著降低。順

11、鉑在8μM的劑量水平上能有效地抑制新生血管形成,當(dāng)它與100ng/ml、200ng/ml的恩度聯(lián)合使用時(shí)具有協(xié)同的抗血管形成作用,聯(lián)合用藥組的血管分支數(shù)明顯低于單藥組,兩者之間有顯著性差異(P<0.05)。 5.DNA微陣列資料經(jīng)數(shù)據(jù)篩選后,鑒定出1241個(gè)符合入選標(biāo)準(zhǔn)的基因,包括1小時(shí)547個(gè)基因,2小時(shí)694個(gè)基因。對(duì)這些被顯著調(diào)節(jié)的基因進(jìn)行功能群分類后,發(fā)現(xiàn)部分基因參與了HUVECs的發(fā)育、定位、凋亡、細(xì)胞骨架和形態(tài)塑形等

12、功能。其中,JUNB、GATA2、INSR、F7和WNT1等重要的血管形成相關(guān)基因的表達(dá),在聯(lián)合用藥時(shí)被同向調(diào)節(jié)的程度較單藥大2倍以上,這些基因可能參與了抗血管形成的增效作用。 6.在6個(gè)目標(biāo)基因中,JUNB、GATA2、INSR的基因芯片表達(dá)資料與實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果一致,FN1、F7基因表達(dá)趨勢(shì)在兩種方法中基本相符,FASL基因芯片測(cè)定結(jié)果未能在實(shí)時(shí)定量RT-PCR上得到驗(yàn)證。 結(jié)論： 1.恩度能選擇性地

13、抑制血管ECs增殖,其劑量-效應(yīng)之間有相關(guān)性,但無(wú)線性關(guān)系。順鉑具有非特異性的抗增殖作用,并且呈現(xiàn)劑量依賴性。 2.恩度和順鉑聯(lián)合使用具有協(xié)同抗血管形成作用,這種協(xié)同作用呈現(xiàn)血管ECs特異性,在兩種肝癌細(xì)胞系上未顯示出該作用。 3.CAM分析表明,在一定的劑量范圍內(nèi),恩度能有效地抑制血管形成,但是當(dāng)劑量過(guò)大時(shí),抗血管形成活性反而下降,說(shuō)明恩度可能存在最佳的劑量-效應(yīng)范圍。恩度和順鉑聯(lián)合使用在體內(nèi)能協(xié)同地抑制新生血管形成。

14、 4.恩度和順鉑聯(lián)合使用顯著地調(diào)節(jié)了一些參與血管形成的基因表達(dá),這些基因涉及到血管形成過(guò)程的多個(gè)環(huán)節(jié)。JUNB、GATA2、INSR、F7和WNT1等重要的效應(yīng)基因,可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF/VEGFR信號(hào)途徑、凝血級(jí)聯(lián)以及WNT信號(hào)途徑等產(chǎn)生抗血管形成的增效作用。這些基因可以作為抗血管形成治療的新“靶點(diǎn)”。 5.實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證了目標(biāo)基因在DNA微陣列上的表達(dá),兩種方法的測(cè)定結(jié)果基本吻合。Agilent人類全基因組