重組人血管抑素的制備及其作用特異性的研究.pdf

1、目的：制備具有滿足臨床應(yīng)用所需純度和生物學(xué)活性的重組人血管抑素(rhAS)，并研究其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的特異性。 方法：轉(zhuǎn)化pQE30(Angiostatin)至大腸桿菌E.Coli(M15)得到表達(dá)rhAS的基因工程菌(E.ColiM15/pQE/AS)，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)rhAS包涵體純化、變性復(fù)性等條件進(jìn)行優(yōu)化研究并鑒定其純度；制備得到的rhAS在人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)、雞胚尿囊膜(CAM)及荷人胰腺癌裸

2、鼠模型上進(jìn)行其生物學(xué)活性及體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)；建立測(cè)定人血漿血管抑素的ELISA方法并進(jìn)行初步應(yīng)用；采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、rhAS-Sepharose4B親和層析、99Tcm標(biāo)記顯像、放射自顯影及組織形態(tài)學(xué)分析等技術(shù)對(duì)HMEC-1細(xì)胞、S180腫瘤和Matrigel模型等進(jìn)行了rhAS的受體及其作用特異性的系列研究。 結(jié)果：經(jīng)轉(zhuǎn)化的基因工程菌可由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)rhAS，其最佳發(fā)酵條件為菌體A600nm為0.8～1.0時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)

3、，加入誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為0.1mmol/L，加入誘導(dǎo)劑后培養(yǎng)時(shí)間為6h。rhAS包涵體純化的最佳方法為：0.2％脫氧膽酸鈉→去離子水→2mol/LGu·HCl；rhAS變性復(fù)性最佳條件為：按1∶10(w/v)加入變性緩沖液(8mol/LGu·HCl，15mmol/LDTT)，然后將Gu·HCl變性液按1∶15(v/v)加入緩沖液稀釋，再按1∶10(v/v)對(duì)含GSH(1mmol/L)：GSSG(0.1mmol/L)氧化還原對(duì)的緩沖

4、液進(jìn)行透析復(fù)性。rhAS既可抑制HMEC-1細(xì)胞的增殖，也可誘導(dǎo)其凋亡；可明顯抑制CAM上血管的生成和有效地抑制人胰腺癌的生長(zhǎng)。建立了可行的測(cè)定人血漿血管抑素的ELISA方法。采用rhAS-Sepharose4B親和層析法得到了一系列HMEC-1細(xì)胞上的rhAS結(jié)合蛋白，其中ATP合酶α/β亞基及Actin為AS受體。HMEC-1細(xì)胞、S180腫瘤及Matrigel模型均可特異地結(jié)合rhAS。結(jié)論：通過(guò)對(duì)基因工程菌發(fā)酵條件、rhAS包涵