重組人Ⅱ型膠原250-270多肽的鑒定及其特異性免疫調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以多關(guān)節(jié)侵蝕破壞為特征的全身性炎性自身免疫病。發(fā)病率約為0.3～1.0％，致殘率和死亡率均高。RA的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，迄今尚無根治療法。 口服耐受是指口服某種抗原物質(zhì)后機(jī)體對該抗原再次接觸時(shí)表現(xiàn)的一種免疫無應(yīng)答狀態(tài)，可以作為治療許多疾病特別是自身免疫性疾病的手段，并具有無毒、方便和抗原特異性的特點(diǎn)，因此，口服耐受成為免疫學(xué)和臨床研究的熱點(diǎn)。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎是采用￠ò型膠原￠ò免疫膠原敏感品系的鼠類

2、，從而誘導(dǎo)多關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生。CIA動(dòng)物模型的癥狀和關(guān)節(jié)病理變化與RA 相似，被廣泛用于研究人類RA發(fā)病機(jī)制和探索治療新方法。已有研究表明，口服CⅡ或CⅡ免疫顯性多肽可抑制CIA 的發(fā)展。合成CⅡ250-270 多肽內(nèi)含有免疫顯性T 細(xì)胞表位CⅡ260-270，可誘導(dǎo)敏感品系小鼠發(fā)生CIA 和免疫耐受，對研究CIA 和RA 的發(fā)病機(jī)理和治療都具有重要意義。 化學(xué)合成多肽技術(shù)復(fù)雜、代價(jià)昂貴、產(chǎn)量少和難于標(biāo)準(zhǔn)化，無法滿足基礎(chǔ)研究和臨

3、床應(yīng)用的需要，而采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組多肽產(chǎn)品則可以解決這一問題。因此，本研究對重組人CⅡ250-270 基因進(jìn)行表達(dá)，獲得了重組人CⅡ250-270 多肽，對此肽段進(jìn)行分離、純化和鑒定。 雖然，應(yīng)用口服抗原誘導(dǎo)免疫耐受治療自身免疫性疾病，在許多動(dòng)物模型中己取得了令人滿意的結(jié)果。但在臨床以此方法治療RA 患者時(shí)，結(jié)果卻不盡人意。為探討口服耐受在治療RA 中確切機(jī)制和效果，本研究通過給予CIA 小鼠早期口服低劑量CⅡ250-

4、270 多肽，觀察其對CIA 的特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，建立了在單細(xì)胞水平上對抗原特異性淋巴細(xì)胞的檢測體系，使用流式細(xì)胞儀同時(shí)分析溴代脫氧尿嘧啶核苷摻入、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子、細(xì)胞表面活化標(biāo)志并采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測特異性抗體和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測定法檢測抗原特異性抗體形成細(xì)胞的綜合檢測方法，有助于更好地理解口服耐受的免疫學(xué)機(jī)制。 目的: 獲得大量rhCⅡ250-270 多肽，鑒定并確認(rèn)rhCⅡ250-270

5、 多肽與預(yù)期的相符。建立一種評估抗原特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的免疫標(biāo)記和方法，有助于口服耐受在疾病治療的研究。研究CⅡ250-270 多肽在RA 和CIA 發(fā)病中作用及其機(jī)制，并為應(yīng)用口服CⅡ250-270 多肽治療RA 提供理論依據(jù)。 方法: 1. rhCⅡ250-270 多肽的表達(dá)、純化和鑒定：在E.coli BL21 中表達(dá)rhCⅡ250-270 蛋白多肽，用親和層析法分離純化。用限制性酶切法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（p

6、olymerase chain reaction，PCR）法、基因序列測定法、瓊脂糖凝膠電泳法、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sodiumdodecyl sulphate-polyacrylamine gel electrophoresis，SDS-PAGE）和免疫印跡法（Western Blotting）等方法在基因和蛋白水平上對rhCⅡ250-270 多肽進(jìn)行鑒定。 2. rhCⅡ250-270 多肽免疫原性的研究

7、：以不同濃度（0.5、1.0、2.0mg/mL）的6 聚rh CⅡ250-270 和（20、200 、2000μg/mL）CⅡ刺激體外培養(yǎng)的RA 患者PBMC，等濃度的PBS 作為陰性對照，PHA 刺激組作為陽性對照。流式細(xì)胞儀測定刺激前后各組培養(yǎng)細(xì)胞中T 細(xì)胞表面活化標(biāo)志性抗原（CD69，CD25）的表達(dá)及5-溴脫氧尿嘧啶（BrdU）在DNA 中的摻入；rhCⅡ250-270 免疫CIA 敏感小鼠DBA/1，比較與CⅡ和合成CⅡ250

8、-270免疫后在體內(nèi)血清特異性抗體水平的差異。 3. 建立CIA 模型和誘導(dǎo)口服耐受：雞Ⅱ型膠原(chicken collagen Ⅱ，CCⅡ)在DBA/1 小鼠(H-2q 單倍型)尾部皮內(nèi)注射，定期觀察并進(jìn)行關(guān)節(jié)評分；在CⅡ免疫小鼠前一周，給予口服rhCⅡ250-270 多肽（0.5mg/mL）或合成多肽（0.1mg/mL），分別兩次。 4. rhCⅡ250-270 多肽對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脾臟特異性T 淋巴細(xì)胞活化及增殖實(shí)

9、驗(yàn)：取加強(qiáng)免疫后7d 治療組和CIA 對照組的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，體外經(jīng)CⅡ250-270、CⅡ和PHA 刺激培養(yǎng)后，采用BrdU 摻入法和流式細(xì)胞術(shù)同時(shí)測定CⅡ特異性T 細(xì)胞增殖情況、細(xì)胞膜表面標(biāo)志；并通過流式細(xì)胞術(shù)測定外周血中CD4+T 細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4 (interleukin-4，IL-4)的水平分析輔助性T 細(xì)胞1（helper T cell 1，Th1）和T

10、h2 亞群的變化。 5. rhCⅡ250-270 多肽對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脾臟特異性B 淋巴細(xì)胞反應(yīng)：用ELISA 法測定加強(qiáng)免疫后7d 各組小鼠血清中抗CⅡ抗體的表達(dá)；用ELISPOT 法檢測加強(qiáng)免疫后7d 各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞特異性抗CⅡ抗體形成脾細(xì)胞。 6. 組織病理學(xué)檢查：加強(qiáng)免疫后6周，取小鼠的炎癥關(guān)節(jié)進(jìn)行HE 染色。觀察關(guān)節(jié)病變的變化情況并對其進(jìn)行評分。 結(jié)果: 1. 純化的rhCⅡ250-270

11、多肽，大小約43 kD，純度為89.3％。EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切法和PCR法得到的DNA大小約為500bp和650bp，與預(yù)期的522bp和679bp基本相符，基因序列測定證實(shí)基因DNA序列與設(shè)計(jì)的完全相符。SDS-PAGE結(jié)果顯示rhCⅡ250-270多肽目的蛋白條帶的大小約為43 kD，與設(shè)計(jì)預(yù)期相符。Western Blotting結(jié)果顯示GST融合蛋白上存在CⅡ片段。 2. rhCⅡ250-270多肽能刺激RA患者

12、PBMC中的特異性淋巴細(xì)胞活化和增殖反應(yīng)，同樣可以誘導(dǎo)CIA敏感小鼠特異性抗體的活化，血清抗體水平與CⅡ和合成CⅡ250-270免疫組無顯著性差異。提示重組CⅡ250-270具有CⅡ及合成CⅡ250-270相似的免疫學(xué)活性。 3. DBA/1小鼠口服重組CⅡ250-270或合成CⅡ250-270多肽后， CIA的發(fā)病率低于對照組（口服PBS），關(guān)節(jié)炎評分也較對照組明顯降低，關(guān)節(jié)炎發(fā)病延遲，且體重未減輕,而CIA對照組小鼠的體重

13、則有所下降。表明CⅡ250-270多肽可在一定程度上減輕CIA小鼠病情。 4. 口服CⅡ250-270多肽可誘導(dǎo)對小鼠脾細(xì)胞中的抗原特異性T細(xì)胞的活化增殖及IFN-γ的分泌的抑制?？诜﨏Ⅱ250-270 多肽小鼠脾細(xì)胞中CD3+CD25+ 抗原特異性T細(xì)胞的百分比（18.76％）比對照組（30.67％）明顯下降， P<0.01；口服rhCⅡ250-270多肽0.5mg組和syCⅡ250-270多肽0.1mg組CD3+BrdU+

14、 T細(xì)胞的百分比分別為27.67％和24.79％，明顯低于對照組（50.46％）， P<0.01；口服CⅡ250-270多肽組脾細(xì)胞用rhCⅡ250-270多肽再刺激后，分泌IFN-γ的陽性細(xì)胞率為9.86％和12.89％，明顯低于對照組的24.36％， P<0.01。 5. 口服CⅡ250-270小鼠血清中抗CⅡ和抗CⅡ250-270 的IgG抗體水平[A值分別為（0.82 ± 0.02）、（0.84 ± 0.04）]比CⅡ

15、免疫對照組[抗CⅡ的IgG抗體水平，A值為（1.01 ± 0.06）]顯著降低，而且特異性抗CⅡ250-270的IgG抗體反應(yīng)在口服多肽組被明顯抑制（ P<0.01）。同時(shí)，口服CⅡ250-270小鼠的CⅡ和CⅡ250-270特異性抗體形成脾細(xì)胞的增殖頻率分別為（158 ± 9計(jì)數(shù)/孔）、（181 ± 10計(jì)數(shù)/孔），比CⅡ免疫對照組[CⅡ特異性抗體形成脾細(xì)胞的增殖頻率為（247 ± 16計(jì)數(shù)/孔）]也顯著減少（ P<0.05）。

16、 6. 組織病理學(xué)觀察，口服CⅡ250-270多肽，CIA小鼠關(guān)節(jié)破壞情況也得到了改善。炎細(xì)胞浸潤、滑膜增生和血管翳的形成，軟骨及骨組織損傷，口服rhCⅡ250-270多肽0.5mg組和syCⅡ250-270多肽0.1mg組，比口服PBS對照組，組織病理學(xué)評分均有所降低。 結(jié)論: 本研究對rhCⅡ250-270多肽進(jìn)行了較全面的鑒定，發(fā)現(xiàn)此肽段具有較強(qiáng)的免疫原性，可刺激RA患者PBMC中的特異性淋巴細(xì)胞活化和增殖反