異丙酚及DMSO上調(diào)人臍靜態(tài)內(nèi)皮細胞HO-1表達的實驗研究.pdf

1、臨床麻醉中常用的靜脈麻醉藥異丙酚因為其酚結構而具有抗氧化應激作用，大量的體外和體內(nèi)研究已經(jīng)證實了異丙酚的細胞和器官保護作用。先前的研究認為異丙酚抗氧化應激作用的機制包括清除H2O2，減少脂酯過氧化物的形成，減少一氧化氮合酶的形成及穩(wěn)定線粒體膜。最近的研究提出異丙酚可能是通過上調(diào)血紅素合酶1(hemeoxygenase-1，HO-1)來發(fā)揮細胞保護作用的。HO-1也稱為熱休克蛋白32，HO-1對細胞的保護作用源于其代謝產(chǎn)物的抗炎及抗氧化應

2、激作用。然而，研究認為在正常狀態(tài)下，僅大劑量的異丙酚能夠誘導HO-1表達上調(diào)，而臨床相關劑量的異丙酚能否影響HO-1表達變化尚不清楚。有絲分裂激酶蛋白家族(Mitogen-actived protein kinases，MAPKs)，核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)及活化狀態(tài)的核因子相關因子2(Nuclearfactor-E2 related factor2，Nrf2)參與HO-1表達上調(diào)的信號轉(zhuǎn)導。若臨

3、床相關劑量的異丙酚能夠誘導HO-1表達上調(diào)，那么這些信號分子很可能參與這一過程的信號傳導。因此，在正常及氧化應激狀態(tài)下，臨床相關劑量的異丙酚能否上調(diào)HO-1的表達以及MAPKs，NF-κB和Nrf2是否參與異丙酚介導的HO-1表達上調(diào)尚不清楚，此外，若臨床相關劑量的異丙酚在正常或氧化應激狀態(tài)下能夠誘導HO-1表達上調(diào)，那么這種表達上調(diào)是否參與或部分參與異丙酚的細胞保護作用(抗凋亡等)有待于細胞學實驗來闡明。在這個背景下，本研究第一部分擬

4、探討臨床相關劑量的異丙酚對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)HO-1mRNA和蛋白表達的作用及其細胞保護作用是否與HO-1有關，同時觀察MAPKs、NF-κB和Nrf2在這一過程中是否具有信號傳遞作用。
　　 本研究第一部分中異丙酚的溶劑二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)可與許多有機溶劑及水相溶。在臨床，DMSO具有一定的治療作

5、用，已成功用于治療肺腺癌，胃腸疾病，慢性前列腺炎，皮膚疾病，還可以作為一種區(qū)域鎮(zhèn)痛藥物。然而，DMSO治療作用的潛在分子機制尚不清楚。在進行本研究第一部分實驗時，意外發(fā)現(xiàn)大劑量的DMSO能夠誘導HO-1mRNA表達上調(diào)。鑒于DMSO在臨床的應用，我們推測DMSO的藥物治療等保護作用可能與誘導HO-1表達上調(diào)有關，因此首先通過系統(tǒng)的實驗來明確DMSO能否誘導HO-1表達上調(diào)及活性增加尤為重要。由于DMSO同樣對MAPKs具有激活或抑制作用

6、，因此，與本研究第一部分的研究設計相同，第二部分實驗擬探討DMSO作用于HuVECs對HO-1mRNA和蛋白表達及酶活性的影響，同時研究MAPKs，NF-κB和Nrf2在其中的信號轉(zhuǎn)導作用。
　　 實驗第一部分的結果表明在正常狀態(tài)下，臨床相關劑量的異丙酚在HUVECs不能誘導HO-1 mRNA表達上調(diào)，而在H2O2誘導的氧化應激狀態(tài)下，異丙酚以劑量和時間依賴的方式增加了HO-1mRNA和蛋白表達水平及酶活性。在氧化應激狀態(tài)下ER

7、Ks特異性阻斷劑PD98059顯著降低了異丙酚所引起的HO-1蛋白表達上調(diào)，而p38-MAPKs和JNKs阻斷劑SB203580和SP600125對異丙酚所引起的HO-1蛋白上調(diào)無顯著作用。這些數(shù)據(jù)表明，ERKs信號通路參與了異丙酚所引起的HO-1上調(diào)的信號傳導。進一步研究證實在氧化應激狀態(tài)下，異丙酚以劑量相關的方式增加ERKs磷酸化水平，這種作用被PD98059所阻斷。此外，異丙酚能夠顯著降低H2O2在內(nèi)皮細胞引起的細胞凋亡率。進一步

8、而言，異丙酚的這種保護作用可部分被HO-1特異性阻斷劑ZnPPIX所阻斷，因此表明HO-1是異丙酚在臍靜脈內(nèi)皮細胞保護作用的一個重要分子機制。H2O2可增加NF-κB p65磷酸化水平及核轉(zhuǎn)移，而異丙酚單獨應用時對NF-κB p65磷酸化水平及核轉(zhuǎn)移無顯著影響，但當異丙酚與H2O2聯(lián)合應用時NF-κBp65磷酸化水平及核轉(zhuǎn)移水平較單獨應用H2O2時顯著上調(diào)，說明異丙酚在氧化應激狀態(tài)下能夠增加NF-κBp65磷酸化水平及核轉(zhuǎn)移，進一步的研

9、究表明這一過程可被ERKs阻斷劑PD98059阻斷，提示NF-κB可能是ERKs信號通路最終導致HO-1表達上調(diào)的下游信號分子。
　　 實驗第二部分的結果表明DMSO能夠在HUVECs誘導HO-1mRNA和蛋白表達上調(diào)及活性增加，當DMSO濃度為0.1％時顯著增加HO-1蛋白表達水平。0.8％的DMSO作用于HUVECs達到1h后，HO-1的蛋白表達水平呈顯著上調(diào)。0.2％的DMSO作用于HUVECs10h對HO-1酶活性的上調(diào)

10、水平具有統(tǒng)計學意義。用0.8％的DMSO作用于HUVECs時間達到8h時，HO-1酶活性顯著增加。JNKs抑制劑SP600125顯著阻斷了DMSO誘導的HO-1蛋白表達上調(diào)。然而，ERKs和JNKs抑制劑PD98059和SB203580卻對此過程無明顯作用。在此基礎上，本研究進一步發(fā)現(xiàn)0.8％的DMSO以時間依賴的方式增加JNKs磷酸化水平，而對ERKs和p38-MAPKs的磷酸化水平卻無顯著影響。這些數(shù)據(jù)充分表明JNKs激活參與了DM

11、SO所介導HO-1表達上調(diào)的信號傳導。DMSO以時間依賴的方式增加Nrf2的核內(nèi)蓄積。在EMSA實驗中，在無DMSO處理的內(nèi)皮細胞，未發(fā)現(xiàn)與Nrf2結合復合物，而在DMSO處理的細胞中，Nrf2的核轉(zhuǎn)移和DNA結合顯著增加?？寡趸磻Y合物在DMSO處理10min鐘后開始增加并持續(xù)至60min。為進一步證實Nrf2在DMSO上調(diào)HO-1的作用，本研究采用Nrf2siRNA干擾Nrf2的表達，結果顯示Nrf2-siRNA可將DMSO誘

12、導的HO-1表達減少38％。由此，充分說明了Nrf2在DMSO上調(diào)HO-1中的作用。
　　 本研究首次報道了異丙酚和DMSO在HUVECs能夠誘導HO-1mRNA和蛋白表達上調(diào)并且初步明確這兩個過程中的潛在分子機制。鑒于內(nèi)皮細胞系統(tǒng)在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起著重要的屏障作用，因此本研究的結果能夠為麻醉藥異丙酚在一些特殊臨床情況下應用提供新的理論基礎，如發(fā)生腦缺血再灌注損傷時。本研究第二部分發(fā)現(xiàn)DMSO為HO-1的一種新型藥理學誘導劑