低氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞Brm表達(dá)上調(diào)的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　低氧性肺動(dòng)脈高壓(Hypoxia Pulmonary Hypertension，HPH)是高原心臟病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，以持續(xù)性的肺血管的收縮和肺血管改建為基本特征。HPH會(huì)導(dǎo)致右心負(fù)荷加重，進(jìn)而引起右心功能不全，嚴(yán)重者可發(fā)展為右心衰竭甚至死亡。HPH的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，目前仍不十分清楚，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，肺血管炎癥免疫反應(yīng)和肺血管活性物質(zhì)分泌失衡是HPH發(fā)生過(guò)程中的重要機(jī)制，而細(xì)胞黏附分子(cell adhesion

2、 molecules，CAMs)和內(nèi)皮素1(Endothelin1，ET-1)表達(dá)增多是介導(dǎo)肺血管炎癥反應(yīng)和血管張力增加的兩個(gè)關(guān)鍵因素。前期研究發(fā)現(xiàn)，低氧可誘導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)蛋白Brm(brahma)表達(dá)上調(diào)。Brm在CAMs和ET-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮表觀遺傳調(diào)控作用，并在HPH肺血管炎癥反應(yīng)、肺血管結(jié)構(gòu)改建及右心室肥厚中發(fā)揮重要作用。但低氧如何誘導(dǎo)Brm表達(dá)增多，其機(jī)制目前尚不明確。
　　Brm是染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物SWI/SNF（sw

3、itching/sucrose non-fermentation）的核心ATP酶亞單位，也是調(diào)節(jié)核小體結(jié)構(gòu)改變和基因轉(zhuǎn)錄的核心蛋白。Brm可定位到核小體，水解ATP釋放能量，實(shí)現(xiàn)對(duì)核小體的重排和置換，從而在真核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　在低氧應(yīng)激條件下，很大一部分基因的表達(dá)受到低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，此外，表觀遺傳調(diào)控機(jī)制也在低氧應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要

4、作用。其中，以H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物(COPASS)介導(dǎo)H3K4甲基化為代表的組蛋白修飾在基因的轉(zhuǎn)錄激活中具有重要作用。
　　因此，本研究著重關(guān)注了低氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中Brm表達(dá)上調(diào)的調(diào)控機(jī)制，結(jié)合生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步明確低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)及組蛋白H3K4甲基化修飾在低氧誘導(dǎo)Brm轉(zhuǎn)錄激活中的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　1.以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human Umbilical Vein Endothelia

5、l Cells，HUVEC)作為細(xì)胞模型，將細(xì)胞置于低氧工作站內(nèi)低氧培養(yǎng)(1％O2、5％CO2、94％N2)一定時(shí)間(12h、24h、48h)后，提取mRNA和蛋白質(zhì)，采用RT-PCR和WB方法檢測(cè)Brm基因的mRNA及蛋白表達(dá);構(gòu)建Brm基因的啟動(dòng)子質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染啟動(dòng)子質(zhì)粒后進(jìn)行低氧培養(yǎng)，采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)Brm啟動(dòng)子活性。
　　2.通過(guò)轉(zhuǎn)染外源性的HIF-1α過(guò)表達(dá)質(zhì)?；騭iRNA干擾內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)源性的HIF-1α表達(dá)

6、后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)Brm的啟動(dòng)子活性，采用RT-PCR方法檢測(cè)Brm的mRNA表達(dá)，采用WB方法檢測(cè)Brm的蛋白表達(dá)。并進(jìn)一步采用染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）技術(shù)檢測(cè)低氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α與Brm啟動(dòng)子的結(jié)合變化，明確HIF-1α活化Brm轉(zhuǎn)錄的機(jī)制
　　3.通過(guò)向內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染外源性的H3K4甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物核心亞單位Wdr5(WD Repe

7、at Domain5)和Ash21(ASH2Like Histone Lysine Methyltransferase Complex Subunit)過(guò)表達(dá)質(zhì)?；騭iRNA干擾內(nèi)源性的Wdr5、Ash21表達(dá)后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)Brm的啟動(dòng)子活性，采用RT-PCR方法檢測(cè)Brm的mRNA表達(dá)，采用WB方法檢測(cè)Brm的蛋白表達(dá)。采用ChIP技術(shù)檢測(cè)低氧處理的內(nèi)皮細(xì)胞中Brm啟動(dòng)子區(qū)域H3K4甲基化水平變化情況。
　　

8、結(jié)果：
　　1.內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Brm啟動(dòng)子質(zhì)粒后低氧(1％O2)培養(yǎng)24h，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)Brm啟動(dòng)子活性。
　　結(jié)果：顯示：與常氧組比，低氧可顯著升高Brm啟動(dòng)子活性;低氧培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間(12h、24h、48h)后與常氧對(duì)照組相比Brm的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，并隨低氧培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，有顯著的時(shí)效關(guān)系。
　　2.與常氧對(duì)照組相比，低氧刺激可顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α與Brm啟

9、動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合;向內(nèi)皮細(xì)胞中成功導(dǎo)入外源性的HIF-1α過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，顯著提高HIF-1α的mRNA及蛋白表達(dá)水平。內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HIF-1α能顯著增強(qiáng)低氧誘導(dǎo)的Brm的啟動(dòng)子活性，Brm的mRNA及蛋白表達(dá)也顯著增加;采用siRNA干擾成功內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)源性的H IF-1α表達(dá)后，HIF-1α的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著受到抑制。干擾內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)能顯著抑制低氧誘導(dǎo)的Brm的啟動(dòng)子活性，Brm的mRNA及蛋白表達(dá)也顯著降低。

10、
　　3.與常氧對(duì)照組相比，低氧處理組Brm啟動(dòng)子周?chē)腍3K4的三甲基化水平顯著增加;內(nèi)皮細(xì)胞中成功導(dǎo)入外源性的Wdr5和Ash21過(guò)表達(dá)質(zhì)粒可顯著上調(diào)Wdr5和Ash21的mRNA及蛋白表達(dá)，低氧時(shí)Brm的啟動(dòng)子活性、mRNA及蛋白表達(dá)水平較常氧對(duì)照組顯著升高;采用siRNA干擾內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)源性的Wdr5和Ash21表達(dá)后，低氧時(shí)Brm的啟動(dòng)子活性、mRNA及蛋白表達(dá)水平較常氧對(duì)照組顯著降低。
　　結(jié)論：
　　1.

11、低氧可顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞中Brm的啟動(dòng)子活性，上調(diào)其mRNA和蛋白表達(dá)水平，表明轉(zhuǎn)錄激活是低氧上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞Brm表達(dá)的重要機(jī)制。
　　2.低氧可促進(jìn)HIF-1α與Brm啟動(dòng)子結(jié)合，并調(diào)控Brm的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，表明HIF-1α在低氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中Brm表達(dá)上調(diào)中發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　3.內(nèi)皮細(xì)胞中Brm的轉(zhuǎn)錄活性同時(shí)受其啟動(dòng)子周?chē)鶫3K4三甲基化水平的影響，低氧可顯著增加Brm啟動(dòng)子區(qū)域H3K4的三甲基化水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)Br