內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急慢性肝損傷中的作用及部分機(jī)制.pdf

1、肝臟是體內(nèi)最大的生物代謝器官,也是外源性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物攻擊的主要靶器官。機(jī)體短期接觸較大劑量外源性物質(zhì)可引起急性肝損傷,在外來因素長期作用下,如果不能完全修復(fù),可發(fā)展成慢性肝損傷。肝纖維化是各種慢性肝損傷的共有病理變化,其持續(xù)發(fā)展為肝硬化可引起肝功能衰竭甚至肝細(xì)胞癌,已成為一個(gè)危害人類生命健康的世界性問題。但目前急慢性肝損傷作用的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,仍未發(fā)現(xiàn)十分確定、特效的藥物,因此,深入研究急慢性肝損傷的發(fā)病機(jī)制,為臨床尋找理想的

2、抗肝損傷藥物,尤其是抗纖維化的藥物,具有重要的理論和臨床意義。
　　最近研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ER Stress)在許多肝臟疾病中發(fā)揮了重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一種重要的細(xì)胞器,負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成、折疊、組裝和運(yùn)輸?shù)?。在外來因素刺激作用?細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài),引起未折疊蛋白反應(yīng),它本是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制,但當(dāng)應(yīng)激持續(xù)發(fā)生時(shí),則會(huì)激活脂肪生成、炎癥和凋亡等途徑,引

3、發(fā)一系列的病理性反應(yīng)。最近的一些研究也顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在急慢性肝損傷形成過程中發(fā)揮了一定在作用,與肝纖維化的形成密切相關(guān)。然而,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與急慢性肝損傷,尤其是肝纖維化的確切機(jī)制尚未完全闡明。
　　四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)誘導(dǎo)的急慢性肝損傷模型是研究肝損傷機(jī)制的經(jīng)典模型之一。本研究首先觀察了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白在CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷中的變化,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝纖維化中的作

4、用及部分機(jī)制,主要內(nèi)容概括如下:
　　1ER stress在CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷中的作用
　　1.1CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷
　　為探討ER stress在小鼠急性肝損傷中的作用,本研究在經(jīng)腹腔單次注射CCl4(0.3ml/kg BW)后不同時(shí)點(diǎn)(0,2,6,12,24和72h)分別剖殺小鼠,稱量體重和肝臟質(zhì)量,留取血液和肝臟組織。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常對照組相比,CCl4在處理后12h小鼠肝重與肝指數(shù)明顯增加,以7

5、2h最顯著;CCl4處理后2h即引起ALT明顯升高,24h達(dá)最高峰,升高約千倍,72h接近對照組正常值。病理組織學(xué)檢查顯示CCl4處理6h后,引起明顯的氣球樣變和點(diǎn)狀壞死;12h進(jìn)展為塊狀壞死;至24h壞死最顯著,肝細(xì)胞呈大片壞死;72h壞死區(qū)域有大量的炎性細(xì)胞浸潤。
　　1.2CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠肝臟ER Stress效應(yīng)
　　為觀察急性肝損傷小鼠肝臟ER Stress效應(yīng),采用免疫組化技術(shù)檢測急性肝損傷小鼠肝臟GR

6、P78分布的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常對照組相比,在CCl4處理后2h,在少量肝細(xì)胞中出現(xiàn)GRP78棕黃色特異性染色,6h肝細(xì)胞特異性染色呈明顯的帶狀分布,12h肝細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域性特異性染色,24h肝細(xì)胞特異性染色分布最廣且最深,72h肝細(xì)胞GRP78特異性染色明顯減弱。
　　采用Western blotting技術(shù)檢測GRP78蛋白表達(dá)以及下游IRE1α、eIF2α蛋白磷酸化水平和ATF6核蛋白水平的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常對照

7、組相比,在CCl4處理后6h肝臟組織GRP78顯著升高,在12h達(dá)到高峰,并持續(xù)至24h,在72h恢復(fù)至正常對照水平;在CCl4處理后2h,肝臟組織IRE1α蛋白磷酸化水平顯著升高,至12h肝臟組織IRE1α蛋白磷酸化水平仍明顯升高;在CCl4處理后12h,肝臟組織eIF2α蛋白磷酸化水平明顯升高,并持續(xù)至72h,以24h磷酸化水平最顯著;在CCl4處理后6 h肝臟組織ATF6核蛋白水平顯著升高,在24h升高最為顯著,在72h恢復(fù)至正常

8、對照水平。上述結(jié)果提示CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中發(fā)生ER Stress效應(yīng)。
　　1.3急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化
　　為觀察急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化,采用TUNEL技術(shù)進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常對照組相比,在CCl4處理后2至12h,僅有少量肝臟細(xì)胞發(fā)生凋亡,在24h有大量區(qū)域性肝細(xì)胞發(fā)生凋亡,72h與正常對照組無明顯差異。上述結(jié)果提示CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷模型小鼠在CCl4處理后24h發(fā)生大量區(qū)

9、域性肝細(xì)胞凋亡。
　　1.4內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑PBA對急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷模型小鼠發(fā)生肝細(xì)胞凋亡是否由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo),觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑PBA對急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響,在經(jīng)腹腔注射給予CCl4(0.30ml/kg BW)前24h、12h和在CCl4處理后12h分別經(jīng)腹腔注射給予150mg/kg PBA進(jìn)行干預(yù),在CCl4處理后24h剖殺小鼠,采用TUNEL技術(shù)檢測肝細(xì)胞凋

10、亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與模型組相比,PBA可明顯抑制CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷中發(fā)揮了重要作用,可能與其介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　2 CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化與ER stress效應(yīng)
　　2.1 CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型的建立
　　為建立CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型,每周2次經(jīng)腹腔注射給予CCl40.15ml/kg(按10％溶于橄欖油中),共持續(xù)8周。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常對照組

11、比較,CCl4誘導(dǎo)的小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)水平和總膽紅素(Total bilirubin,TBIL)、直接膽紅素(Direct Bilirubin,DBIL)和總膽汁酸(total biliary acid,TBA)含量以及反應(yīng)肝

12、纖維化程度的組織羥脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)含量均顯著增高;病理組織學(xué)結(jié)果 HE染色提示模型組小鼠肝臟中重度壞死,在壞死組織周圍有大量的炎癥細(xì)胞浸潤,膠原染色提示肝組織有大量膠原沉積,并分割肝組織形成假小葉趨勢。以上結(jié)果提示CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型建立成功。
　　2.2 CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠肝臟ER Stress效應(yīng)
　　為觀察CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型中,是否存在ER Stress效應(yīng),采用

13、Western blotting技術(shù)檢測ER stress效應(yīng)標(biāo)志性蛋白GRP78蛋白表達(dá)以及下游IRE1α、eIF2α磷酸化水平和ATF6核蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常對照組相比,CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型小鼠肝臟GRP78蛋白表達(dá)顯著上調(diào),IRE1α、eIF2α磷酸化水平以及ATF6核蛋白水平顯著增加。以上結(jié)果提示CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型發(fā)生ER stress效應(yīng)。
　　3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑PBA對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的

14、影響
　　為進(jìn)一步探討ER stress在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化形成過程中的作用,采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑PBA進(jìn)行干預(yù),觀察ER stress效應(yīng)被抑制后,對CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的影響,PBA+CCl4干預(yù)組,在每周2次經(jīng)腹腔注射給予0.15ml/kg CCl4的同時(shí),每天兩次經(jīng)腹腔注射給予150mg/kg PBA,共持續(xù)8周。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與肝纖維化模型組相比,PBA干預(yù)顯著降低小鼠肝重和肝指數(shù),并明顯降低血清DBIL、TBA水平和

15、肝組織Hyp含量;病理學(xué)組織結(jié)果,PBA干預(yù)明顯減輕肝臟組織炎癥細(xì)胞數(shù)量與肝臟壞死程度,改善肝組織結(jié)構(gòu),減少膠原沉積。
　　α-SMA是肝星狀細(xì)胞激活的標(biāo)志,采用免疫組化技術(shù)和Western blotting技術(shù)分析α-SMA蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與模型組比較,PBA干預(yù)顯著降低小鼠肝臟α-SMA的蛋白表達(dá)。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測肝纖維化關(guān)鍵性細(xì)胞因子TGF-β1 mRNA水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與模型組相比較,PBA干預(yù)顯著降低

16、 TGF-β1 mRNA水平。
　　采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測肝臟膠原標(biāo)志物Col1a1和Col1a2 mRNA水平以及膠原降解相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)中Mmp2和Mmp9 mRNA、金屬蛋白酶組織抑制因子( tissue inhibitor of metallopeptidases,TIMPs)中Timp1和Timp2 mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,

17、肝纖維化模型組小鼠Col1a1、Col1a2、Mmp2、Mmp9、Timp1、Timp2 mRNA水平顯著增加;與模型組相比,PBA干預(yù)顯著抑制Colla1、Colla2、Mmp2和Timp1 mRNA水平。以上結(jié)果提示:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與增加小鼠肝臟膠原纖維表達(dá)有關(guān)。
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證ER stress在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化中的作用,采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑PBA進(jìn)行干預(yù),觀察對肝纖維化小鼠的ER stress效應(yīng)的影響,采用West

18、ern blotting技術(shù)檢測GRP78蛋白表達(dá)、IRE1α、eIF2α磷酸化水平和ATF6核蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與模型組相比,PBA干預(yù)明顯抑制CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟GRP78蛋白表達(dá)的上調(diào)作用,降低IRE1α、eIF2α磷酸化水及核蛋白ATF6水平。以上結(jié)果進(jìn)一步提示PBA可以抑制CCl4誘導(dǎo)的肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng),進(jìn)一步證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝纖維化的形成過程中發(fā)揮了重要的作用。
　　4 ER stress在C

19、Cl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化中的作用機(jī)制
　　4.1 ER stress介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化中的作用
　　為進(jìn)一步研究ER stress在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化中的作用機(jī)制,采用Western blotting和實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型組以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑干預(yù)組對NF-κB信號(hào)通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常對照組相比,CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型小鼠肝臟細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子

20、NF-κB p65核蛋白水平顯著增加;與模型組相比,PBA干預(yù)顯著降低細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65核蛋白水平。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測NF-κB信號(hào)通路下游靶基因TNF-αmRNA水平,結(jié)果顯示:肝纖維化模型組小鼠肝臟TNF-α mRNA水平明顯增高;與模型組相比,PBA干預(yù)顯著降低TNF-α mRNA水平。以上結(jié)果提示ER stress在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠中的作用機(jī)制,可能與其介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路及炎癥反應(yīng)有關(guān)。

21、>　　4.2 ER stress介導(dǎo)的MAPKs信號(hào)通路在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化中的作用
　　為進(jìn)一步研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化作用中的機(jī)制,采用Western blotting技術(shù)檢測CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型組以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑干預(yù)組對MAPKs信號(hào)通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常對照組相比,CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型組小鼠ERK和JNK磷酸化水平顯著增加,而p38的磷酸化水平明顯降低;與模型組相比,PBA干預(yù)

22、顯著降低肝臟 ERK和JNK的磷酸化水平,對肝臟磷酸化的p38的表達(dá)無明顯影響。以上結(jié)果提示ER stress在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化形成過程中的作用機(jī)制,可能與其介導(dǎo)的ERK和JNK信號(hào)通路有關(guān)。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合表明,ER stress在CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷發(fā)揮了重要的作用,可能與其介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡有關(guān);ER stress在CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷——肝纖維化過程中也起了十分重要的作用,其作用機(jī)制可能與其介導(dǎo)的NF