骨關(guān)節(jié)炎血清蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:對(duì)正常人群及骨關(guān)節(jié)炎患者的血清蛋白電泳圖譜進(jìn)行配對(duì)分析比較，尋找差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。應(yīng)用質(zhì)譜鑒定技術(shù)，對(duì)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定。經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)檢索，分析所鑒定的蛋白質(zhì)在骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系。為今后骨關(guān)節(jié)炎致病機(jī)制研究，生物標(biāo)記物尋找，新的治療靶點(diǎn)的研究奠定基礎(chǔ)。 材料與方法: 10名符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的膝關(guān)節(jié)OA患者(1名男性和9名女性，平均年齡60.6±7.4，BMI25.8±4.4)和10名正常志愿者(1名男性和9名女性，平均年齡55

2、.3±4.5，BMI25.5±3.5)分別組成病例組與對(duì)照組，兩組性別相匹配，年齡、BMI相當(dāng)以減少混雜因素。本實(shí)驗(yàn)符合相關(guān)衛(wèi)生部門的倫理委員會(huì)的原則。嚴(yán)格執(zhí)行赫爾辛基宣言的相關(guān)規(guī)定，并且已征得所有入組人員的同意。對(duì)所有研究對(duì)象收集靜脈血，在每個(gè)樣本上加入蛋白酶抑制劑，然后分離血清樣本保存在-80℃?zhèn)溆谩?0微升血清樣本放入1mL的離心管里面，根據(jù)ProteoPrepBlueAlbumin＆IgGDepletionKit(SIGMA)

3、試劑盒和2-Dcleanupkit(AmershamBiosciences)試劑盒的說明分別用于清除樣本中的白蛋白與球蛋白和鹽與脂。然后利用牛血清作為標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)用Bradford法測(cè)定濃度。按照G(o)rg等方法和Bio-Rad儀器操作手冊(cè)進(jìn)行雙相電泳。第一相等電聚焦(IEF)，血清的上樣量總體積為0.35ml，(含總蛋白質(zhì)0.3mg)。50V重泡脹12h后進(jìn)行等電聚焦，依次經(jīng)過150V1h、500V3h、1000V1h、5000V1h、7

4、000V2h、10000V至總電壓積為50000伏小時(shí)。等電聚焦結(jié)束后，迅速取出IPG膠條，分別置于平衡液A(6mmol/LUrea，2％SDS，50mmol/LTris—HCLpH8.8，30％甘油，2％DTT)、平衡液B(6mmol/LUrea，2％SDS，50mmol/LTris—HCLpH8.8，30％甘油，2.5％碘乙酰胺)中各平衡15分鐘。將平衡好的膠條轉(zhuǎn)入proteanⅡxicell垂直電泳槽中進(jìn)行第二向電泳，聚丙烯酰胺凝

5、膠濃度為12％，電泳條件為：每膠3W電泳30min，然后每膠7W恒功率，直至溴酚藍(lán)指示線到達(dá)凝膠底部停止電泳，對(duì)凝膠進(jìn)行銀染。凝膠通過ImageScannerⅡ透射掃描儀及Labscan掃描軟件進(jìn)行掃描獲取圖像。數(shù)據(jù)以SPSS15.0進(jìn)行處理。軟件找出差異點(diǎn)后沿邊緣切取凝膠上的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)(表達(dá)量差異在3倍以上)，置于1.5mlEP管內(nèi)。蛋白點(diǎn)經(jīng)脫色，脫水，抽干。加入5uL～10ulTPCK處理的胰蛋白酶(12.5ng/uL)，4℃冰箱

6、中約30分鐘，取出后在37℃烘箱中酶解過夜。加入50％乙腈和0.1％TFA混合液60uL，輕微振蕩萃取30-40min后，將溶液轉(zhuǎn)移到新的96孔板內(nèi)，重復(fù)3次。將肽段溶液在N2流下吹干濃縮，然后將完全干燥的肽段重新溶解于0.7uLCHCA溶液(0.5g/L，由0.1％TFA和50％CAN配制)中，并將其全部點(diǎn)到不銹鋼MALDI靶板上并分析。MALDI—TOF—MS分析采用反射模式，正離子譜測(cè)定，激光源為355nm波長(zhǎng)的Nd：YAG激光器

7、，加速電壓為20KV。儀器先用myoglobin酶解肽段進(jìn)行外標(biāo)校正?；|(zhì)和樣品的PMF質(zhì)量掃描范圍為700-3500Da。然后直接選擇與對(duì)照基質(zhì)的PMF圖有差異的肽段離子進(jìn)行MS/MS分析。所有實(shí)驗(yàn)樣品的質(zhì)譜圖均用默認(rèn)模式獲得。利用軟件Mascotdistiller過濾基線峰、識(shí)別信號(hào)峰。利用Matrixscience公司的Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.matrixscience.com)，尋找匹配的相

8、關(guān)蛋白質(zhì)，同時(shí)查詢其功能，來明確鑒定的蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。 結(jié)果: 1、通過二維電泳圖普比較發(fā)現(xiàn)7個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中6個(gè)在關(guān)節(jié)炎組中呈低表達(dá)，1個(gè)呈高表達(dá)。 2、經(jīng)質(zhì)譜鑒定為分別為：6個(gè)低表達(dá)蛋白分別為對(duì)氧磷酶1、對(duì)氧磷酶3、α-1-微球蛋白/bikunin前體蛋白、載脂蛋白M、免疫球蛋白輕鏈(或與之極類似的推定的未知特性蛋白)、四連接素，高表達(dá)蛋白為載脂蛋白LI。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示APO