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文檔簡(jiǎn)介
1、骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是多種因素引起的以關(guān)節(jié)軟骨退變和軟骨下骨重塑及骨贅形成為病理特征的關(guān)節(jié)疾患。近年來,OA的發(fā)病率逐年增高,已成為老年人致殘的主要疾病之一。合適的動(dòng)物模型是大規(guī)模開展OA基礎(chǔ)和臨床研究的基石。幾十年來國(guó)內(nèi)外相繼報(bào)道了多個(gè)動(dòng)物模型,然而各個(gè)模型的系統(tǒng)研究仍待深入。既往研究已證實(shí)OA患者的血液及關(guān)節(jié)液的成分較正常人及其他炎性關(guān)節(jié)病有明顯的不同,說明隨著OA的發(fā)生、發(fā)展,病變可以通過體液環(huán)境反映出來
2、,進(jìn)而對(duì)體液環(huán)境產(chǎn)生重要的影響。反之,參與關(guān)節(jié)疾病的各種細(xì)胞生活在改變了的體液環(huán)境中,必然會(huì)因?qū)Νh(huán)境產(chǎn)生變化。本試驗(yàn)通過改良Hulth法造模后,對(duì)此模型進(jìn)行了系列研究,并比較不同時(shí)期骨關(guān)節(jié)炎兔血清對(duì)軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響,為探討骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制及骨關(guān)節(jié)炎軟骨修復(fù)時(shí)機(jī)等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的:1.通過觀察改良Hulth法造模后不同時(shí)期兔膝關(guān)節(jié)的大體和病理特點(diǎn),研究其復(fù)制不同時(shí)期骨關(guān)節(jié)炎的可行性;2.對(duì)造模后不同時(shí)期兔
3、血清NO含量、軟骨細(xì)胞凋亡率及軟骨Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA進(jìn)行檢測(cè),為此模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)并探討骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制;3.對(duì)造模不同時(shí)期軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),并觀察不同時(shí)期骨關(guān)節(jié)炎血清環(huán)境對(duì)正常軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響,進(jìn)而探討血清學(xué)環(huán)境與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病及軟骨修復(fù)的關(guān)系。 方法:1.取成年新西蘭大白兔16只,雌雄各半,隨機(jī)分組,對(duì)Hulth造模法進(jìn)行改良,將兔右膝關(guān)節(jié)作為實(shí)驗(yàn)側(cè),作膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切斷、內(nèi)側(cè)半月板切除,左膝作為
4、對(duì)照側(cè)。分別于造模后2,6,10,14周時(shí)觀察膝關(guān)節(jié)的大體和組織病理學(xué)特點(diǎn)。軟骨病理采用Mankin評(píng)分進(jìn)行評(píng)定。2.提取造模前及造模后不同時(shí)期兔血清,冷凍保存,參照改良Gress法對(duì)血清NO含量進(jìn)行檢測(cè)。3.采用TUNNEL軟骨細(xì)胞凋亡檢測(cè)法,對(duì)造模后不同時(shí)期骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行流失細(xì)胞儀檢測(cè)。4.應(yīng)用RT-PCR的方法,檢測(cè)造模后不同時(shí)期骨關(guān)節(jié)炎軟骨與正常軟骨collagenⅡ和aggrecan的表達(dá)情況,β-actin作為
5、內(nèi)參照。5.采用酶消化培養(yǎng)法對(duì)造模后不同時(shí)期,實(shí)驗(yàn)側(cè)及對(duì)照側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行消化培養(yǎng),利用倒置相差顯微鏡觀察體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和生物學(xué)特性,采用MTT法檢測(cè)其細(xì)胞增殖情況。6.取凍存的正常及造模后不同時(shí)期兔血清,與正常幼兔軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。 結(jié)果:1.對(duì)照各組各時(shí)間點(diǎn)Mankin評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),造模各組與對(duì)照組,及造模各組間
6、Mankin評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);2.正常組和造模2周組與造模6周、10周、14周組血清NO含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),造模6周、10周及14周組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);3.經(jīng)X2檢驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)軟骨細(xì)胞凋亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);4.造模各組與正常組相比,及造模各組之間collagenⅡ和aggrecan mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。5.各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)原代軟骨細(xì)胞增殖活性有統(tǒng)計(jì)學(xué)
7、差異(P<0.01)。尤其是造模10周時(shí),有明顯差異(P<0.001)6.不同時(shí)期骨關(guān)節(jié)炎兔血清對(duì)正常軟骨細(xì)胞和MSC細(xì)胞形態(tài)和增殖有重要影響。 結(jié)論:(1)采本研究通過改良Hulth模型,14周內(nèi)成功復(fù)制出膝不同時(shí)期骨關(guān)節(jié)炎,證實(shí)了此種改良方法的可行性;血清NO含量增高,NO含量造模6周后與病理分期無明確相關(guān)。而隨著病理分級(jí)進(jìn)展,軟骨細(xì)胞凋亡率相應(yīng)增加;Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA的表達(dá),造模一段時(shí)間都有增高的趨勢(shì),在造模10周
8、達(dá)到最高峰,然而在極晚期病變出現(xiàn)時(shí),又都快速下降,與病理進(jìn)展有一定相關(guān)性;(2)本實(shí)驗(yàn)采用原代軟骨細(xì)胞機(jī)械分離及胰蛋白酶、Ⅰ型及Ⅱ膠原酶的序貫、聯(lián)合消化法,可以對(duì)骨關(guān)節(jié)炎原代軟骨細(xì)胞進(jìn)行良好的分離和傳代培養(yǎng)。體外培養(yǎng)在造模中晚期,病變側(cè)軟骨細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于正常對(duì)照側(cè),且形態(tài)學(xué)差異不大。并提出采用骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞作為軟骨組織工程種子細(xì)胞來源的可能性;(3)本研究發(fā)現(xiàn),造模不同時(shí)期骨關(guān)節(jié)炎兔血清對(duì)正常軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為具
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