骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞表型異常分子機(jī)制的蛋白組學(xué)研究.pdf

1、研究背景
　　 骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）缺損軟骨修復(fù)是醫(yī)學(xué)界亟待攻克的難題。大量研究表明：OA軟骨細(xì)胞發(fā)生去分化和異常再分化，表達(dá)軟骨細(xì)胞正常分化表型蛋白Ⅱ型膠原和aggrecan減少，而開始表達(dá)終末分化表型蛋白X型膠原，以及異常表型Ⅰ型和Ⅲ型膠原等。OA病理環(huán)境下軟骨細(xì)胞的異常分化狀態(tài)，是軟骨細(xì)胞修復(fù)功能缺失、軟骨自我修復(fù)失敗的原因之一。
　　 雙向蛋白電泳（2-dimensional gel e

2、lectrophoresis，2-DE）作為一項高效的差異表達(dá)蛋白分離技術(shù)，為研究軟骨細(xì)胞分化異常的分子機(jī)制提供了技術(shù)支持。但是，由于組織軟骨細(xì)胞中含有大量蛋白多糖影響2-DE的蛋白等電聚焦，而軟骨細(xì)胞培養(yǎng)卻又可能因離體環(huán)境導(dǎo)致OA病理表型以及表型調(diào)控分子丟失，以2-DE研究OA軟骨細(xì)胞表型異常的分子機(jī)制因此面臨難題。
　　 研究目的
　　 探索一種既能避免蛋白多糖干擾2-DE等點聚焦，又能避免細(xì)胞培養(yǎng)導(dǎo)致OA病理表型以

3、及表型調(diào)控分子丟失的實驗方案，實現(xiàn)應(yīng)用2-DE研究OA軟骨細(xì)胞表型異常分化分子機(jī)制的目的。隨后，通過研究2-DE分離蛋白的功能及差異表達(dá)概況，達(dá)到對OA軟骨細(xì)胞表型調(diào)控分子機(jī)制更深入的認(rèn)識。并在此基礎(chǔ)上，對部分新發(fā)現(xiàn)的軟骨細(xì)胞表型調(diào)控蛋白的功能進(jìn)行探討。
　　 研究方法
　　 新鮮軟骨組織取自接受膝關(guān)節(jié)表面置換手術(shù)的OA患者（n=19）和因外傷接受截肢手術(shù)的下肢損毀傷患者（n=13）或接受全/半髖關(guān)節(jié)置換的股骨頸骨折患者

4、（n=7）。按照Outerbridge分級，將軟骨組織按區(qū)域劃分為三組：Outerbridge2級（OAⅡ組）、Outerbridge1級（OAI組）和正常對照組（Outerbridge0級）（NC組）。采用0.2％Ⅱ型膠原酶和0.1％透明質(zhì)酸酶混合物DMEM溶液37℃振蕩消化4h，分離軟骨細(xì)胞。軟骨細(xì)胞計數(shù)后，每106個細(xì)胞離心后單獨凍存。來自10個不同患者的軟骨細(xì)胞（共107個軟骨細(xì)胞）混合后，直接提取胞漿可溶蛋白。改良的Bradf

5、ord法測定蛋白濃度后，取100pg蛋白/膠上樣進(jìn)行2-DE分析。2-DE凝膠銀染顯色蛋白點，圖像掃描并輸入凝膠圖像分析軟件ImageMaster2-D Platinum（V3.0）進(jìn)行差異表達(dá)蛋白組間對比。確認(rèn)的差異表達(dá)蛋白點切膠消化，提交質(zhì)譜分析，以確認(rèn)蛋白質(zhì)的身份。根據(jù)確認(rèn)蛋白的生物信息，結(jié)合對應(yīng)差異表達(dá)蛋白點在蛋白凝膠中的位置，確認(rèn)質(zhì)譜結(jié)果的正確性。
　　 采用real-time RT-PCR技術(shù)對差異表達(dá)蛋白質(zhì)之一，R

6、EST轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子1（REST corepressor1，CoREST1），在正常和OA軟骨細(xì)胞之間的差異表達(dá)概況進(jìn)行驗證。隨后，采用RNA干擾技術(shù)對CoREST1在正常軟骨細(xì)胞中的基因表達(dá)進(jìn)行敲降，探討CoREST1表達(dá)下調(diào)對軟骨細(xì)胞表型的調(diào)控作用。應(yīng)用real-time RT-PCR技術(shù)挑選基因敲降效率最高的siRNA，確認(rèn)實現(xiàn)CoREST1基因表達(dá)的有效敲降。CoREST1成功敲降后，應(yīng)用real-time RT-PCR觀察軟

7、骨細(xì)胞正常分化表型蛋白Ⅱ型膠原和aggrecan、軟骨細(xì)胞終末分化表型X型膠原和向成纖維細(xì)胞再分化的異常表型蛋白Ⅰ型膠原等表型基因表達(dá)水平的變化，研究CoREST1表達(dá)下調(diào)對軟骨細(xì)胞表型的影響。隨后，采用RNA原位雜交技術(shù)觀察CoREST1基因表達(dá)在正常和OA軟骨組織中的表達(dá)和分布。
　　 研究結(jié)果
　　 實驗成功實現(xiàn)了軟骨細(xì)胞胞漿可溶蛋白的2-DE等電聚焦，獲得了高質(zhì)量的2-DE電泳圖像。差異對比分析出135個差異表達(dá)

8、蛋白點，并實現(xiàn)對其中31個差異表達(dá)蛋白點身份的確認(rèn)。這些蛋白中包括軟骨細(xì)胞病理表型蛋白annexin A2、神經(jīng)多肽h3和病理性表達(dá)上調(diào)的Ⅵ型膠原，以及一系列具有軟骨細(xì)胞表型調(diào)控功能的蛋白質(zhì)。其中，蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、前膠原脯氨酸2-酮戊二酸雙加氧酶以及TGF-β2在OAⅡ軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶7和REST抑制輔助因子1（REST corepressor1，CoREST1）在OA組軟骨細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。Real-t

9、ime RT-PCR結(jié)果證實OAI組CoREST1 mRNA表達(dá)水平相比NC下降45.3％（Mann-Whitney U test，Z=-2.382，P=0.016），而OAⅡ組下降達(dá)49.6％（Mann-Whitney U test，Z=-2.648，P=0.005），具備組間顯著性差異。siRNA對原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞CoREST1基因表達(dá)的敲降效率達(dá)到平均95.7％。CoREST1基因。mRNA被有效敲降后，Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)水平

10、相應(yīng)下調(diào)83.0％（T test，P<0.01），aggrecan的mRNA表達(dá)水平下調(diào)50.7％（T test，P<0.01）。此外，Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平也下調(diào)91.0％（T test，P<0.01），而X型膠原的mRNA水平反而上升43.7％，但與CoREST1敲降前相比無顯著性差異（T test，P=0.066）。RNA原位雜交結(jié)果顯示CoREST1基因表達(dá)下降主要見于Outerbridgel級軟骨的過渡層和Outerbrid

11、ge2級軟骨深層。
　　 結(jié)論
　　 （1）本文通過優(yōu)化并采用直接從軟骨組織中提取軟骨細(xì)胞，不經(jīng)培養(yǎng)直接提取可溶蛋白用于雙向電泳研究的方案，同時避免細(xì)胞培養(yǎng)導(dǎo)致的軟骨表型相關(guān)蛋白丟失和蛋白多糖對2-DE等點聚焦的干擾，成功實現(xiàn)了應(yīng)用雙向電泳技術(shù)研究OA軟骨細(xì)胞異常分化的分子機(jī)理。
　　 （2）annexin A2、神經(jīng)多肽h3和病理性表達(dá)上調(diào)的Ⅵ型膠原在重度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)升高，驗證了既往有關(guān)軟骨細(xì)胞表型異常的

12、文獻(xiàn)報道。
　　 （3）具有軟骨細(xì)胞表型調(diào)控功能的蛋白在OA軟骨細(xì)胞中差異表達(dá)的矛盾狀況，說明OA軟骨細(xì)胞表型調(diào)控的分子機(jī)制處于混亂狀態(tài)。
　　 （4）首次發(fā)現(xiàn)CoREST1在OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，并證實CoREST1下調(diào)可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞去分化，提示CoREST1是OA軟骨細(xì)胞去分化的病因分子。CoREST1在導(dǎo)致去分化的同時，并不誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞終末分化或引起類似培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的向成纖維細(xì)胞表型異常再分化。