基于蛋白組學(xué)的艾灸治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的研究.pdf

1、背景：
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥性自身免疫病。特征為關(guān)節(jié)滑膜病變、骨質(zhì)侵蝕[1-2]。此病致殘率較高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。艾灸作為傳統(tǒng)中醫(yī)護理技術(shù)之一，對改善RA的臨床癥狀具有療效較好、毒副作用小等特點，但其具體作用機制尚未闡明，更未見蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)報道。
　　目的：
　　應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)尋找并鑒定艾灸治療RA模型大鼠滑膜組織的蛋白質(zhì)表達(dá)

2、變化，探討治療機制，為臨床運用艾灸治療RA提供現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證據(jù)。
　　方法：
　　(1)建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（Collgen-Induced-Arthritis，CIA）模型大鼠。模型成功后隨機分為6組，艾灸Ⅰ組，艾灸Ⅱ組，艾灸Ⅲ組，模型Ⅰ組，模型Ⅱ組，模型Ⅲ組，每組各6只雄性SD大鼠。艾灸組選取雙側(cè)足三里、腎俞穴溫和灸治療。Ⅰ組干預(yù)1周，Ⅱ組干預(yù)2周，Ⅲ組干預(yù)3周。模型組不予治療。另設(shè)正常雄性SD大鼠18只隨機分為正常Ⅰ組，正

3、常Ⅱ組，正常Ⅲ組，每組6只。
　　(2)基線比較:比較各組大鼠造模前體重、足趾腫脹度。
　　(3)比較艾灸Ⅲ組、模型Ⅲ組、正常Ⅲ組艾灸干預(yù)3周后大鼠一般情況。
　　(4)比較艾灸Ⅲ組、模型Ⅲ組、正常Ⅲ組干預(yù)前、干預(yù)1周、2周、3周大鼠體重、足趾腫脹情況。
　　(5)比較艾灸Ⅲ組、模型Ⅲ組干預(yù)前、干預(yù)1周、2周、3周關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分。
　　(6)收集艾灸Ⅲ組、模型Ⅲ組、正常Ⅲ組干預(yù)3周后大鼠滑膜組織標(biāo)本，HE染

4、色法觀察病理形態(tài)改變。
　　(7)干預(yù)1周、2周、3周收集9組大鼠滑膜組織標(biāo)本，雙向電泳。軟件分析比對各時間點艾灸組、模型組、正常組。選取各時間點模型組與艾灸組的共同差異蛋白點作為艾灸治療的差異蛋白點。應(yīng)用MALDI-TOF MS鑒定差異蛋白點。搜索NCBI數(shù)據(jù)庫確定差異蛋白，并應(yīng)用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)軟件分析差異蛋白參與的生物功能、信號通路及信號網(wǎng)絡(luò)等。
　　結(jié)果：
　　(1

5、)各組大鼠造模前體重、足趾腫脹度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。
　　(2)3周后，正常Ⅲ組大鼠表現(xiàn)正常，模型Ⅲ組大鼠飲食、活動減少，關(guān)節(jié)強直，艾灸Ⅲ組大鼠飲食、活動及關(guān)節(jié)強直情況有所改善。
　　(3)艾灸Ⅲ組、模型Ⅲ組各時間點大鼠的體重、足趾腫脹與正常Ⅲ組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，兩組體重較正常Ⅲ組減輕，足趾腫脹較正常Ⅲ組加重。艾灸Ⅲ組在體重恢復(fù)、改善足趾腫脹方面較模型Ⅲ組有優(yōu)勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意

6、義(P＞0.05)。
　　(4)艾灸Ⅲ組、模型Ⅲ組干預(yù)前關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分均大于4分，干預(yù)后各時間點艾灸Ⅲ組較模型Ⅲ組有改善趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(5)干預(yù)3周后，正常Ⅲ組大鼠滑膜HE染色正常。模型Ⅲ組可見明顯滑膜增生、炎性浸潤。艾灸Ⅲ組滑膜變薄，炎癥減輕。
　　(6)各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜雙向電泳圖譜清晰，蛋白點分離完全。每張凝膠圖譜辨識(1316.7±24.7)個蛋白點，組內(nèi)蛋白點平均匹配率90％-

7、93％。模型組與艾灸組第1、2、3周差異蛋白點分別為365個、332個和202個。三個時間點共同表達(dá)差異蛋白點9個。經(jīng)質(zhì)譜分析及NCBI數(shù)據(jù)庫檢索，9個差異蛋白點都匹配到相應(yīng)蛋白質(zhì)，生物功能主要涉及器官形態(tài)、骨骼肌肉功能、免疫功能、炎性反應(yīng)和疾病、血液系統(tǒng)功能、結(jié)締組織功能等。
　　(7) IPA分析發(fā)現(xiàn):艾灸主要通過調(diào)節(jié)過氧化物還原酶Ⅰ(PRDXⅠ)、3-羥酰基-輔酶A脫氫酶(EHHADH)、肌球蛋白輕鏈3(MLC3)、血紅素結(jié)

8、合蛋白(HPX)等蛋白并分別經(jīng)由NRF2-介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)通路(NRF2-mediated Oxidative Stress Response)、脂肪酸β-氧化通路Ⅲ（Fatty Acidβ-oxidationⅢ）、急性期反應(yīng)通路(Acute Phase ResponseSignaling)、細(xì)胞骨架肌動蛋白通路(Acin Cytoskeleton Sigmling)、上皮細(xì)胞黏附通路（Epithelial Adherens Junc

9、tion Signaling）等，從而參與功能涉及DNA復(fù)制、重組和修復(fù)，細(xì)胞集結(jié)和炎性反應(yīng)的信號網(wǎng)絡(luò)，最終調(diào)控本研究中RA的發(fā)生與發(fā)展。
　　結(jié)論：
　　(1)本實驗中，艾灸可改善CIA模型大鼠飲食等一般活動情況，且三個療程后病理切片顯示輕度滑膜細(xì)胞腫脹及少量炎性細(xì)胞浸潤，說明艾灸具有一定的抗炎免疫作用，但足部紅腫情況在短時間難以改善。
　　(2)鑒定了艾灸持續(xù)干預(yù)RA的9個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，提示艾灸可調(diào)節(jié)RA大鼠滑膜

10、組織多種蛋白質(zhì)表達(dá)。主要通過調(diào)節(jié)PRDXⅠ、EHHADH、MLC3、HPX等蛋白并經(jīng)由NRF2-mediated Oxidative Stress Response、Fatty Acidβ-oxidationⅢ、Acute Phase ResponseSignaling、Acin Cytoskeleton Signaling、Epithelial Adherens Junction Signaling等通路，從而參與功能涉及DNA復(fù)制、