TNF-α增強Doxorubicin抗腫瘤作用機制的研究.pdf

1、目的：癌癥是世界性的主要健康問題之一,但是現(xiàn)在對癌癥的治療并不樂觀,化療作為癌癥治療的一種方法,半個多世紀(jì)以來一般選用的都是細(xì)胞毒性的試劑,對正常的非正常的細(xì)胞都有殺傷作用,而且其毒性呈現(xiàn)劑量相關(guān)性,因此找到一種既能降低化療藥物用量又不影響其殺傷腫瘤細(xì)胞效果的方法對癌癥的治療顯得尤為重要。
　　方法：①利用Cell Titer-glo試劑盒,通過檢測ATP的水平來檢測細(xì)胞存活率。可以指示藥物TNF-α、Doxorubicin(以下

2、簡稱為 Dox)分別及聯(lián)合處理后對細(xì)胞的殺傷作用；②利用siRNA即小干擾RNA轉(zhuǎn)染來沉默某個基因以檢測該基因在藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡這條信號通路中是否參與；③Western blotting技術(shù)用來檢測siRNA沉默的效果；④免疫沉淀技術(shù)用來檢測相互作用蛋白；⑤動物實驗:構(gòu)建結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的裸鼠異種移植腫瘤模型,檢測藥物TNF-α、Dox分別及聯(lián)合處理后裸鼠腫瘤體積大小的影響。
　　結(jié)果：⑴Dox在較高濃度可引起胰腺癌細(xì)胞

3、Panc-1死亡,但在該濃度下Dox對正常心肌細(xì)胞HL-1已產(chǎn)生損傷,Dox毒副作用大。⑵TNF-α可以增強腫瘤細(xì)胞對Dox的敏感性。在我們選用的三種腫瘤細(xì)胞內(nèi)分別是胰腺癌細(xì)胞系Panc-1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G、結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116,均可以看到TNF-α?和Dox的協(xié)同作用后對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更明顯。⑶Caspase-8參與調(diào)控TNF-α聯(lián)合Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡信號通路。Caspase-8的沉默能明顯的阻止TNF-α聯(lián)合D

4、ox引起的細(xì)胞死亡,而且TNF-α聯(lián)合Dox引起的細(xì)胞死亡可以被caspase抑制劑z-VAD所抑制。⑷Dox單獨引起的細(xì)胞死亡與caspase-8無關(guān),且不能被z-VAD抑制。Dox單獨引起的細(xì)胞死亡依賴于溶酶體內(nèi)的蛋白酶Cathepsin B,Cathepsin B的沉默能明顯阻止Dox單獨引起的細(xì)胞死亡。⑸RIP1參與調(diào)控TNF-α?聯(lián)合Dox引起的細(xì)胞凋亡。RIP1的沉默明顯阻止TNF-α聯(lián)合Dox引起的細(xì)胞死亡。⑹CYLD(R

5、IP1的去泛素化酶)調(diào)控TNF-α?聯(lián)合Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。利用RNAi方法干擾CYLD能阻止TNF-α?聯(lián)合Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。⑺TNF-α聯(lián)合Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中,cIAP1/2蛋白不發(fā)生降解。⑻TNF-α聯(lián)合 Dox可誘導(dǎo) RIP1/FADD/caspase-8蛋白復(fù)合體的形成。用TNF-α+Dox處理細(xì)胞后,利用caspase-8抗體進行免疫沉淀,可以檢測到FADD和RIP1存在于caspase-8的蛋白復(fù)合體中。⑼c

6、-FLIP過表達(dá)能夠阻止TNF-α聯(lián)合DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。⑽TNF-α能夠增強 Dox在體內(nèi)的抗腫瘤作用。我們構(gòu)建了一個裸鼠體內(nèi)異種移植動物模型,待給藥后隔天對腫瘤體積進行檢測,我們發(fā)現(xiàn)TNF-α能夠增強Dox在體內(nèi)的抗腫瘤作用。
　　結(jié)論：通過體內(nèi)體外的實驗,我們發(fā)現(xiàn)TNF-α能夠增強 Dox的抗腫瘤效果。其下游主要是通過caspase-8/FADD/RIP1/CYLD引發(fā)細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到抗腫瘤效果。這一研究結(jié)果提示TNF-