BFA協(xié)同增強順鉑抗腫瘤的作用及分子機制.pdf

1、目的：探究BFA與順鉑體外抗人肺癌和人卵巢癌的協(xié)同作用及分子機制。
　　方法：將人肺癌細胞（GLC-82）和人卵巢癌細胞（SK-OV-3）分別分為對照組、BFA組、CDDP組、BFA+CDDP組。對各組進行以下實驗：（1）MTT法測定BFA和CDDP單獨及聯(lián)合處理對人肺癌細胞株GLC-82和人卵巢癌細胞株SK-OV-3生長抑制率；（2）藥物聯(lián)合作用指數(shù)（CI）、藥物劑量降低指數(shù)（DRI）和等效圖解法分析兩藥物之間藥效學的相互作用；

2、（3）倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化；（4） DAPI染色，熒光顯微鏡觀察細胞核變化；（5）Annexin V-FITC/PI雙染，流式細胞術檢測細胞凋亡；（6）JC-1染色，流式細胞術檢測線粒體膜電位變化；（7）實時熒光定量 PCR（q-RT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western blot）檢測線粒體凋亡通路、內質網(wǎng)應激標志分子GRP78、GRP94、CHOP及PERK-ATF4通路、IRE1α-XBP1通路、ATF6通路相關基因

3、及Caspase3的表達。
　　結果：（1）MTT結果表明，BFA和CDDP處理GLC-82細胞和SK-OV-3細胞24 h時，對細胞的生長均具有顯著的抑制作用，且呈劑量性依賴，GLC-82細胞的IC50分別為100 ng/ml和4μg/ml，SK-OV-3細胞的IC50分別為450 ng/ml和9μg/ml；且BFA和CDDP聯(lián)合處理各濃度組合CI值絕大多數(shù)小于1，DRI值均大于1，其劑量比例點絕大多數(shù)位于等效線下方。
　

4、?。?）細胞形態(tài)學觀察：藥物處理24 h后，BFA處理組細胞皺縮、變圓，CDDP處理組細胞形態(tài)無明顯變化但有少量凋亡細胞，BFA+CDDP處理組較單獨用藥組細胞皺縮、變圓加劇且凋亡細胞增多；藥物處理48 h后較24 h細胞形態(tài)的異常變化進一步加劇。
　?。?）DAPI染色觀察：藥物處理24 h后，對照組細胞核完整染色均勻，BFA處理組和CDDP處理組細胞核固縮且呈致密濃染，BFA+CDDP處理組與單獨用藥組無明顯差異；藥物處理48

5、 h后，較24 h細胞形態(tài)變化進一步加劇，但BFA+CDDP處理組呈致密濃染細胞核數(shù)量及核裂解碎片顯著增多。
　?。?）流式細胞術檢測凋亡： BFA+CDDP處理 GLC-82細胞凋亡率為（14.1±2.3）％，顯著高于BFA處理組（P<0.01）、CDDP處理組（P<0.01）及對照組（P<0.01）；BFA+CDDP處理 SK-OV-3細胞凋亡率為（17.0±1.3）%，顯著高于BFA處理組（P<0.01）、CDDP處理組（P

6、<0.01）及對照組（P<0.01）。
　?。?）流式細胞術檢測線粒體膜電位： BFA+CDDP處理GLC-82細胞線粒體膜電位下降率為（28.3±0.7）%，顯著高于BFA處理組（P<0.01）、CDDP處理組（P<0.01）及對照組（P<0.01）；BFA+CDDP處理SK-OV-3細胞線粒體膜電位下降率為（13.9±1.7）%，顯著高于BFA處理組（P<0.01）、CDDP處理組（P<0.01）及對照組（P<0.01）。

7、r>　?。?）線粒體凋亡通路相關基因的表達：藥物處理24 h后，與對照組和單獨處理組相比，BFA+CDDP處理組BCL2、 Bax和Cyt C的表達均增加；而48 h后，BCL2表達顯著降低，而Bax和Cyt C的表達仍維持較高的水平。
　　（7）內質網(wǎng)應激凋亡通路相關基因的表達：藥物處理24 h后，與對照組和單獨處理組相比，BFA+ CDDP處理 GLC-82細胞和SK-OV-3細胞 ERS伴侶蛋白GRP78、GRP94以及各通

8、路的相關蛋白PERK、ATF4、IRE1α、XBP1、ATF6、CHOP的表達均上調；而48 h后，GRP78、GRP94、PERK、ATF4、IRE1α、XBP1、ATF6均呈不同程度的下調，但轉錄因子CHOP的表達仍維持較高的水平。
　?。?）Caspase3的表達：藥物處理24 h后，與對照組和單獨處理組相比，BFA+CDDP處理組Caspase3的表達上調，且其剪切激活增加；藥物處理48 h后，Caspase3剪切激活進一