順鉑聯(lián)合exosomes瘤苗抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：順鉑是目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最為廣泛的抗癌藥物之一，大劑量順鉑化療對(duì)癌細(xì)胞殺傷快而強(qiáng)，但對(duì)機(jī)體造成的副作用大。腫瘤疫苗作為機(jī)體內(nèi)在的一種新的治療手段，主要依賴(lài)于激活機(jī)體自身的力量去殺傷瘤細(xì)胞，這種殺傷力是有限的，并且緩慢。腫瘤疫苗聯(lián)合化療，可降低化療藥的劑量，減輕毒副作用。本實(shí)驗(yàn)用小劑量順鉑與小鼠肝癌H22細(xì)胞分泌的exosomes瘤苗聯(lián)合應(yīng)用，評(píng)價(jià)聯(lián)合應(yīng)用的抗腫瘤效果，研究其可能機(jī)制。從而為臨床開(kāi)展化療后的腫瘤疫苗主動(dòng)免疫提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)

2、。 方法： 1.以小鼠肝癌H22細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究順鉑在體外對(duì)H22細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用和順鉑對(duì)H22細(xì)胞Fas表達(dá)的影響：MTT法檢測(cè)順鉑對(duì)H92細(xì)胞的增殖抑制率；RT-PCR和Westernblot分別檢測(cè)順鉑對(duì)H22細(xì)胞Fas的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。 2.采用超速分級(jí)離心和蔗糖密度梯度離心提取純化exosomes瘤苗，以exosomes瘤苗免疫小鼠，RT-PCR檢測(cè)exosomes瘤苗對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)

3、胞FasL表達(dá)的影響。 3.體外觀察exosomes誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）活性及順鉑對(duì)CTL殺傷的增敏作用，應(yīng)用Hoechest33258染色、電鏡觀察H22細(xì)胞凋亡形態(tài)改變。 4.建立BALB/C小鼠肝癌移植瘤模型，從以下幾個(gè)方面觀察順鉑與exosomes聯(lián)合應(yīng)用在體內(nèi)對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用：觀察移植瘤小鼠生存時(shí)間；剝瘤后稱(chēng)重計(jì)算腫瘤抑制率；腫瘤組織行HE染色觀察，超微結(jié)構(gòu)行透射電鏡觀察。

4、 5.在BALB/C小鼠肝癌移植瘤模型上觀察順鉑與exosomes瘤苗對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響：稱(chēng)量各組小鼠胸腺和脾臟的重量，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)；用MTT法檢測(cè)BALB/c小鼠脾細(xì)胞增殖情況和細(xì)胞毒活性；ELISA法檢測(cè)順鉑與exosomes瘤苗治療后小鼠血清中IL-2，INF-γ水平。 結(jié)果： 1.MTT抑制率實(shí)驗(yàn)顯示，順鉑在實(shí)驗(yàn)藥物濃度下對(duì)小鼠肝癌H22細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，其抑制作用隨濃度的增加而增大，呈劑

5、量-效應(yīng)依賴(lài)性。選擇抑制率低的濃度：2.5μg/mL和5μg/mL順鉑作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。RT-PCR和Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)2.5μg/mL和5μg/mL順鉑作用24h后，H22細(xì)胞FasmRNA水平分別升高3.1倍和4.9倍，F(xiàn)as蛋白水平分別升高3.3倍和5.1倍。 2.RT-PCR結(jié)果顯示，exosomes免疫后的小鼠脾淋巴細(xì)胞中，能擴(kuò)增出456bpFasL的特異性目的條帶，未免疫的對(duì)照組脾淋巴細(xì)胞未見(jiàn)擴(kuò)增出

6、FasL的目的基因條帶。 3.低濃度順鉑（2.5μg/mL）預(yù)處理24h后的H22細(xì)胞對(duì)CTL反應(yīng)敏感性增強(qiáng)，在效靶比為10：1、20：1、40：1、80：1時(shí)的殺傷率分別高于單獨(dú)CTL組，順鉑增強(qiáng)了CTL的殺傷效應(yīng)。Hoechest33258染色和電鏡結(jié)果顯示H22細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變。 4.順鉑聯(lián)合exosomes瘤苗對(duì)移植瘤抑制作用最強(qiáng)，移植瘤質(zhì)量為（1.03±0.14）g，抑瘤率為64.4％。HE染色可見(jiàn)聯(lián)合

7、治療組腫瘤組織有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；腫瘤組織超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察，聯(lián)合治療組除見(jiàn)到大量壞死細(xì)胞外，尚有凋亡細(xì)胞和凋亡小體的存在。 5.聯(lián)合治療組與exosomes瘤苗組荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯高于對(duì)照組，單獨(dú)順鉑對(duì)免疫器官影響不顯著。順鉑化療后聯(lián)用Exosomes瘤苗，荷瘤鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)分別為（9.96±0.91）mg/g和（3.51±4.79）mg/g，與對(duì)照組比較明顯提高（P<0.01），且脾淋巴細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞毒

8、活性增強(qiáng)（P<0.01）；順鉑+Exosomes聯(lián)合治療組小鼠血清中IL-2，INF-γ水平分別為（421.51±39.17）pg/mL和（39.86±3.15）pg/mL，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論： 1.順鉑誘導(dǎo)小鼠肝癌H22細(xì)胞Fas表達(dá)上調(diào)，exosomes瘤苗能夠顯著增高小鼠脾淋巴細(xì)胞FasL表達(dá)水平，順鉑與exosomes聯(lián)合治療有協(xié)同抑制腫瘤的作用，產(chǎn)生協(xié)同作用的機(jī)制與增強(qiáng)CTL活