LCE3C在皮膚癌組織中分布和細(xì)胞定位及其調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景和目的：
　　皮膚癌是世界六大常見癌癥之一，其中常見的兩種病理分型分別為皮膚鱗癌（squamous cell carcinoma，SCC）和基底細(xì)胞癌（basal cell carcinoma，BCC）。近年來，皮膚癌的發(fā)病呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，其較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移與侵襲性是造成有機(jī)體病死的主要原因。皮膚癌和銀屑病有一些相似的病理特點(diǎn)，例如表皮增生過度、表皮角化不全等。其中皮膚組織中的一些特異性的分子標(biāo)記如后期角質(zhì)化包膜蛋白（late

2、cornified envelope3C，LCE3C）在銀屑病病人中被發(fā)現(xiàn)表達(dá)是增高的，后期角質(zhì)化包膜蛋白屬于角質(zhì)化包膜蛋白家族，由LCE基因編碼，在正常皮膚中，LCE3C呈現(xiàn)低表達(dá)，當(dāng)皮膚發(fā)生表皮破損與組織炎癥時(shí)，LCE3C被誘導(dǎo)表達(dá)，LCE3C是表達(dá)在胞外的一種粘附分子，在表皮中主要發(fā)揮表皮屏障保護(hù)作用。另一種和表皮層細(xì)胞分化相關(guān)的標(biāo)記分子GRHL3（grainyhead-like3）在表皮的新陳代謝過程中可以促進(jìn)表皮基底層細(xì)胞的遷

3、移，GRHL3是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，又稱為Get1，在表皮屏障中可以促進(jìn)表皮基底層細(xì)胞的遷移，在表皮的正常分化過程中，基底層細(xì)胞會由先前的未分化狀態(tài)逐漸發(fā)展成熟，GRHL3在這一過程中可以促進(jìn)表皮基底層細(xì)胞特異性基因的表達(dá)。因此研究GRHL3在皮膚鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)變化將有助于我們分析LCE3C對皮膚癌的發(fā)病機(jī)制中扮演的作用，為了探討LCE3C蛋白在皮膚鱗狀細(xì)胞癌以及基底細(xì)胞癌中的分布及其調(diào)控的分子機(jī)制，分別從組織水平和細(xì)胞水平分析LCE3C

4、的組織分布和與其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子GRHL3的表達(dá)變化及其與細(xì)胞增殖與劃痕愈合能力的影響。
　　方法:
　　1.利用HE染色分析皮膚鱗癌、基底細(xì)胞癌與正常皮膚組織形態(tài)方面的差異。
　　2.利用免疫組織化學(xué)法檢測LCE3C在銀屑病、皮膚鱗癌、基底細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，正常人皮膚組織做對照。
　　3.根據(jù)Genbank提供的人LCE3C基因mRNA的序列（Genbank序列號：NM_178434.2），利用Primer5.

5、0軟件，設(shè)計(jì)引物，用基因工程的方法構(gòu)建綠色熒光蛋白融合表達(dá)的LCE3C重組表達(dá)載體pLCE3C-GFP。
　　4.將重組表達(dá)載體pLCE3C-GFP、pGFP分別轉(zhuǎn)染人皮膚鱗癌細(xì)胞系A(chǔ)431，用激光共聚焦顯微術(shù)分析LCE3C在A431細(xì)胞中的定位。
　　5.Western blot方法檢測轉(zhuǎn)錄因子GRHL3對LCE3C表達(dá)的影響。
　　6.MTT實(shí)驗(yàn)檢測LCE3C對A431細(xì)胞增殖能力的影響。7.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測LCE

6、3C對A431細(xì)胞在劃痕處的愈合能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.HE染色結(jié)果顯示，和正常人皮膚組織相比，皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌的表皮層分層情況嚴(yán)重紊亂，分層界限不明顯，且基底層、棘層有明顯增厚的跡象。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示，相比于正常人皮膚組織，LCE3C在SCC和BCC組織中LCE3C表達(dá)明顯增加，在皮膚癌組織中LCE3C主要分布在表皮的角質(zhì)層，且主要表達(dá)分布在細(xì)胞核外。
　　3.激光共聚焦結(jié)果顯示，LCE

7、3C主要表達(dá)分布在細(xì)胞核外。
　　4.Western blot結(jié)果顯示，與角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT)相比，A431細(xì)胞中GRHL3表達(dá)量顯著降低，而LCE3C表達(dá)量明顯增高；過量表達(dá)GRHL3的細(xì)胞（A431/GRHL3）LCE3C表達(dá)量顯著降低。
　　5.MTT結(jié)果顯示，相比于正常未轉(zhuǎn)基因的A431細(xì)胞，過量表達(dá)LCE3C的A431/LCE3C-GFP細(xì)胞在12h、24h、48h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞相對增殖率均低于A431細(xì)胞

8、。
　　6.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和正常未轉(zhuǎn)基因的A431細(xì)胞相比，過量表達(dá)LCE3C的A431/LCE3C-GFP細(xì)胞在劃痕處的愈合能力明顯降低。
　　結(jié)論:
　　1.與正常人皮膚組織相比，LCE3C在皮膚癌中的表達(dá)增加，主要分布在皮膚角質(zhì)層的細(xì)胞核外；
　　2.轉(zhuǎn)錄因子GRHL3和LCE3C的表達(dá)在皮膚癌細(xì)胞系A(chǔ)431細(xì)胞中表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)；
　　3.LCE3C在一定程度上可能抑制A431細(xì)胞的增殖與劃痕愈