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文檔簡介
1、目的
頭頸部鱗狀細胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)主要影響口腔、舌咽部、口咽部、喉部以及涎腺等各個方面的功能,在口腔的惡性腫瘤類型中處于第六名的位置。而在口腔頜面部中的惡性腫瘤中,口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)占了相當大的比例,大約80%左右。雖然近幾年我們致力于OSCC的治療以及相關(guān)發(fā)病的機制研究,并且取得了一
2、定程度上的進展以及突破,但是在過去的幾十年期間,口腔鱗狀細胞癌病人的存活率卻始終沒有太過明顯的提升和改善,平均每年確診病例中死亡率仍可以達到50%甚至以上。舌鱗狀細胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)當中最為好發(fā),具有較高的遠處轉(zhuǎn)移率和增殖能力。TSCC通常會導(dǎo)致言語,咀嚼及吞咽功能障礙。雖然,TSCC的治療方案已經(jīng)取得了一定進展,但TSCC的死亡率仍然很高。因此了解
3、參與TSCC發(fā)展進程的分子機制,尋找TSCC的治療靶點,發(fā)現(xiàn)TSCC新的治療策略是有必要的。
microRNA(miRNA)是一類非編碼、并且擁有較小分子量的RNA,它發(fā)揮作用的方式是通過結(jié)合其靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'untranslated region,3'UTR),在轉(zhuǎn)錄以后水平調(diào)控相關(guān)基因的表達。近年有學(xué)者通過實驗發(fā)現(xiàn),多種類型的miRNA分子通過沉默或者抑制癌基因表達的這種方式,從而參與到癌細胞生物程序的調(diào)
4、控之中。已經(jīng)有研究證實,miR-137在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。然而,miR-137在舌鱗狀細胞癌中的作用的尚不清楚。為明確miR-137對舌鱗狀細胞癌生物學(xué)行為的調(diào)控作用,并初步探索其分子生物學(xué)機制。本研究中,檢測了舌鱗狀細胞癌組織及細胞中,miR-137的表達的相對水平,并通過這種細胞轉(zhuǎn)染miR-137mimic或著scramble檢測細胞生物學(xué)行為的方式來改變。合成miR-137靶基因SP1的3’非編碼區(qū)(untranslate
5、d regions,UTR)并插入海腎熒光素酶報告質(zhì)粒。細胞用miR-137 mimic或scramble和pGL3-SP1-3'UTR或MUT3'UTR共轉(zhuǎn)染48 h,利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行測定。從而探討MicroRNA-137對舌鱗狀細胞癌增殖、遷移和侵襲的影響及對其分子調(diào)控機制的初步研究。
方法
第一部分:
miR-137在舌鱗狀細胞癌(TSCC)中的表達及表觀遺傳學(xué)對舌鱗狀細胞癌細胞miR-13
6、7表達的調(diào)控。提取細胞總RNA,隨后反轉(zhuǎn)錄過程成為cDNA,然后用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)來做內(nèi)參,使用實時熒光定量PCR對舌鱗狀細胞癌(TSCC)組織和其相關(guān)對照的正常組織進行一系列相關(guān)檢測,舌鱗狀細胞癌(TSCC)細胞系(SCC4,SCC1,UM1和Cai27)、正??谇唤琴|(zhì)細胞NOK16B細胞系和正??谇唤琴|(zhì)細胞(NHOK) miR-137表達。舌鱗狀細胞癌(TSCC)細胞系SCC1,UM1采用DNA甲基化抑制劑5-氮
7、雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)又或者采用組蛋白脫乙酰酶抑制劑曲古霉素A(TSA)處理24 h。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)用來測定細胞處理后miRNA-137的基因表達。
第二部分:
miR-137通過靶基因SP1對舌鱗狀細胞癌(TSCC)細胞系SCC1生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。MTT試驗、集落形成實驗、細胞侵襲實驗和細胞劃痕實驗來探討miR-137 mimics和scramble轉(zhuǎn)染舌鱗狀細胞癌(TSC
8、C)細胞系SCC1后對腫瘤細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定舌鱗狀細胞癌(TSCC)細胞系SCC1分別轉(zhuǎn)染miR-137 mimics,scramble后E-cadherin,N-catenin,Snail,Vimentin蛋白在舌鱗癌組織中的表達。靶向掃描(TargetScan)探究miR-137潛在的靶增殖基因。對舌鱗狀細胞癌(TSCC)細胞系SCC1用實時熒光定量PCR檢測miR-137 mi
9、mics組、scramble組轉(zhuǎn)染后SP1的表達。應(yīng)用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù),克隆SP1基因的3'UTR區(qū)并連接到熒光素酶報告基因載體pGL3-REPORT上。所構(gòu)建的新載體命名為pGL3-REPORT-SP1-3'UTR。利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-137和SP1基因的靶向關(guān)系。
結(jié)果
第一部分:
用實時熒光定量PCR分別檢測25組舌鱗狀細胞癌(TSCC)組織和25組正常對照組,分別測定了m
10、iR-137的表達。相對于正常對照組,TSCC組織中miR-137的表達下調(diào)。此外,我們也證明,與正??谇唤琴|(zhì)細胞NOK16B細胞系和正??谇唤琴|(zhì)細胞(NHOK)相比,舌鱗狀細胞癌(TSCC)細胞系(SCC4,SCC1,UM1和Ca127)中miR-137表達下調(diào)(P<0.001)。②TSCC細胞系SCC1,UM1用0.5,1.5及3μmol/L5-Aza-CdR(腔角質(zhì)細胞甲基化抑制劑,5-氮雜-2'-脫氧胞苷,5-Aza-CdR)亦
11、或是300 nmol/L的TSA(組蛋白脫乙酰酶抑制劑曲古霉素,Trichostatin A,TSA)處理24 h。我們發(fā)現(xiàn)采用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-CdR),亦或是組蛋白脫乙酰酶抑制劑曲古霉素A(TSA)處理后的舌鱗狀細胞癌(TSCC)細胞系SCC1,UM1中miR-137表達均上調(diào)。
第二部分:
?、賁CC1細胞系miR-137的表達量,轉(zhuǎn)染scramble組和miR-137 mi
12、mic組分別是0.6327±0.12、32.725±0.34(P<0.001)。②MTT實驗中,舌鱗狀細胞癌(TSCC)細胞系SCC1轉(zhuǎn)染miR-137 mimics后,對細胞增殖的抑制能力相較于于對照組來說明顯的提升,且此種差異具有統(tǒng)計學(xué)方面的意義(P<0.05)。在集落形成實驗當中,舌鱗狀細胞癌(TSCC)細胞系SCC1轉(zhuǎn)染miR-137 mimics組細胞集落數(shù)要明顯的低于轉(zhuǎn)染scramble組,而且此種差異具有統(tǒng)計學(xué)的意義(P<
13、0.05),這提示著miR-137的表達可以顯著的降低舌鱗狀細胞癌(TSCC)細胞系SCC1細胞的增殖能力。③轉(zhuǎn)染miR-137 mimics組較轉(zhuǎn)染scramble組,上皮細胞生物學(xué)標志E-鈣粘蛋白的表達升高,間充質(zhì)細胞生物學(xué)標志N-鈣粘蛋白、波性蛋白及Snail的表達降低。這些結(jié)果提示,miR-137抑制SCC1細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,且此種差異具有統(tǒng)計學(xué)的意義(P<0.05)。④我們通過細胞體外侵襲實驗得出結(jié)論:舌鱗狀細胞癌(TSC
14、C)細胞系SCC1轉(zhuǎn)染miR-137 mimics組細胞數(shù)明顯低于轉(zhuǎn)染scramble組,且此種差異具有統(tǒng)計學(xué)的意義(P<0.05),提示miR-137過表達能顯著降低舌鱗狀細胞癌(TSCC)細胞系SCC1細胞的侵襲能力。細胞劃痕試驗中,轉(zhuǎn)染miR-137 mimics組細胞的劃痕愈合速度較慢。提示miR-137過表達能有效的抑制細胞遷移能力,且此種差異具有統(tǒng)計學(xué)方面的意義(P<0.05)。⑤在實時熒光定量PCR的實驗檢測當中我們可以看
15、出,在SCC1細胞中, pGL3-REPORT-SP1-3'UTR與scramble共轉(zhuǎn)染組、pGL3-REPORT-SP1-3'UTR與miR-137 mimics共轉(zhuǎn)染組、pGL3-REPORT-MUT3'UTR與miR-137 mimics共轉(zhuǎn)染組、pGL3-REPORT-MUT3'UTR與scramble共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶相對表達量分別為0.97±0.07、0.47±0.06、0.97±0.08、0.98±0.09,說明miR-
16、137抑制了野生型SP13'UTR載體的熒光素酶活性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在Western-blot檢測當中,SCC1細胞,轉(zhuǎn)染miR-137mimics組與轉(zhuǎn)染scramble組相比較,SP1蛋白的表達量明顯的降低。MTT實驗中,SP1與miR-137 mimics共轉(zhuǎn)染組較control與scramble共轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力明顯增高,且此種差異具有統(tǒng)計學(xué)方面的意義(P<0.05)。在實時熒光定量PCR(qRT-PCR)
17、的相關(guān)檢測當中,在SCC1細胞中,SP1與miR-137mimics共轉(zhuǎn)染組較control與scramble共轉(zhuǎn)染組,上皮細胞生物學(xué)標志E-鈣粘蛋白的表達降低,間充質(zhì)細胞生物學(xué)標志N-鈣粘蛋白、波性蛋白及Snail的表達升高。這些結(jié)果提示,miR-137通過SP1調(diào)控SCC1細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,且此種差異具有統(tǒng)計學(xué)的意義(P<0.05)。
結(jié)論
1、相對于正常對照組織,舌鱗狀細胞癌(TSCC)組織中miR-137
18、的表達下調(diào)。與正常口腔角質(zhì)細胞NOK16B細胞系和正??谇唤琴|(zhì)細胞(NHOK)相比,在舌鱗狀細胞癌(TSCC)細胞系(SCC4,SCC1,UM1和Ca127)中miR-137表達均下調(diào)。
2、在舌鱗狀細胞癌(TSCC)細胞系SCC1細胞中,miR-137表達受表觀遺傳學(xué)調(diào)控。
3、MiR-137抑制舌鱗狀細胞癌(TSCC)細胞系SCC1細胞的增殖能力、集落形成能力、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲和遷移能力。
4、在舌
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