TR3在應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞中分布的變化及其生物學(xué)機(jī)制.pdf

1、目的：觀察應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞中TR3的表達(dá)和亞細(xì)胞定位的變化，研究這種變化的生物學(xué)機(jī)制，為揭示應(yīng)激機(jī)體心肌損傷的病理學(xué)機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。 方法：建立心肌細(xì)胞應(yīng)激損傷的整體動物模型和離體細(xì)胞模型；采用westemblotting方法和細(xì)胞免疫熒光法觀察TR3在應(yīng)激心肌細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位；采用熒光探針流動透析裝置測定整體動物心肌細(xì)胞線粒體靜息態(tài)和能化態(tài)的跨膜電位差；采用流式細(xì)胞術(shù)觀察離體心肌細(xì)胞的凋亡率和線粒體膜電位；采用weste

2、mblotting法測定應(yīng)激心肌細(xì)胞中細(xì)胞色素C在胞漿和線粒體中的含量；構(gòu)建TR3缺失突變體與GFP的融合表達(dá)載體并導(dǎo)入心肌細(xì)胞，尋找應(yīng)激心肌細(xì)胞中TR3線粒體轉(zhuǎn)位的必需氨基酸序列；采用免疫沉淀法檢測應(yīng)激狀態(tài)下心肌細(xì)胞中TR3的絲氨酸磷酸化水平，研究其與TR3在心肌細(xì)胞內(nèi)分布的相關(guān)性。 結(jié)果：應(yīng)激機(jī)體心肌細(xì)胞線粒體中TR3蛋白含量顯著升高，TR3發(fā)生向線粒體的轉(zhuǎn)位；加入核輸出抑制劑LMB后，TR3的核輸出受到阻抑，應(yīng)激心肌細(xì)胞中

3、TR3滯留于胞核，不發(fā)生向線粒體的轉(zhuǎn)位。應(yīng)激條件下TR3向線粒體的轉(zhuǎn)位促進(jìn)心肌細(xì)胞線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換孔開放、線粒體細(xì)胞色素C釋放及心肌細(xì)胞凋亡；加入LMB阻抑TR3的核輸出后，應(yīng)激心肌細(xì)胞中線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換孔開放、線粒體細(xì)胞色素C釋放及心肌細(xì)胞凋亡均受到阻抑。TR3N端的152個氨基酸對應(yīng)激心肌細(xì)胞中TR3發(fā)生線粒體轉(zhuǎn)位進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用。應(yīng)激狀態(tài)下，糖皮質(zhì)激素通過激活PKA通路，導(dǎo)致TR3絲氨酸磷酸化水平的升高進(jìn)而使TR3

4、發(fā)生線粒體轉(zhuǎn)位，從而引發(fā)心肌細(xì)胞線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換孔開放、線粒體細(xì)胞色素C釋放及心肌細(xì)胞凋亡等生物學(xué)作用；加入H．89阻抑PKA通路后，應(yīng)激心肌細(xì)胞中TR3的絲氨酸磷酸化水平降低，TR3的線粒體轉(zhuǎn)位被阻斷，線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換孔開放、線粒體細(xì)胞色素C釋放及心肌細(xì)胞凋亡均受到阻抑。 結(jié)論：應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中TR3向線粒體轉(zhuǎn)移，并繼而活化細(xì)胞凋亡的線粒體通路，引起心肌細(xì)胞凋亡。TR3N端的152個氨基酸是應(yīng)激心肌細(xì)胞中TR3發(fā)生線粒體