去甲斑蝥素對人絨癌和皮膚癌的作用及其機制研究.pdf

1、去甲斑蝥素（Norcantharidin，NCTD）是通過去除斑蝥素分子中2,3-甲基所得的化合物，是我國首先人工合成并擁有獨立知識產(chǎn)權(quán)的新型治癌藥物。與斑蝥素相比，它具有更低的毒性，且具有獨特的升白細(xì)胞作用。已有的研究表明，去甲斑蝥素可以保護正常肝細(xì)胞免受因脂多糖（LPS）導(dǎo)致的損傷；減弱腎小管間質(zhì)纖維化，保護腎臟；還對人身體免疫系統(tǒng)具有良好的調(diào)節(jié)作用。除了以上的特點之外，去甲斑蝥素還具有較強的抗癌活性，它對多種腫瘤具有良好的治療效果

2、。這些腫瘤包括卵巢癌、前列腺癌、宮頸癌、肝癌等。利用抗癌藥提升腫瘤細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是一條潛在的抗癌途徑?；钚匝醯纳呖梢哉T導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬，使細(xì)胞死亡。關(guān)于NCTD對人絨癌及皮膚癌方面的研究仍然知之甚少。我們在前期實驗研究中發(fā)現(xiàn)，NCTD可誘導(dǎo)人絨癌JEG-3細(xì)胞與人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞活性氧明顯升高，至于它能否誘導(dǎo)這兩種癌細(xì)胞凋亡及自噬等情況，值得進(jìn)一步研究。
　　第一部分：NCTD對人絨癌JEG-

3、3細(xì)胞的增殖、凋亡和自噬的影響，以及與5-FU化療增敏作用
　　目的：探討 NCTD對人絨癌 JEG-3細(xì)胞的增殖能力、凋亡和自噬的影響及分子機制。此外，NCTD對絨癌主要化療藥5-FU是否具有增敏作用。
　　方法： MTT實驗檢測細(xì)胞增殖的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖周期，Annexin V-FITC熒光雙染法檢測細(xì)胞凋亡，DAPI染色法和Hochest33258染色法檢測凋亡細(xì)胞形態(tài)，電鏡觀察細(xì)胞凋亡與自噬。我們還使用相

4、關(guān)試劑盒檢測凋亡、活性氧水平、膜電位、自噬陽性細(xì)胞、MDA及Caspase-3,-9酶活性變化，最后用定量PCR方法檢測抗氧化基因的mRNA表達(dá)，Western-blot法檢測P21、CyclinB1、Fas、FasL、Bcl-2、Bax、mTOR、P62、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1. NCTD對人絨癌JEG-3細(xì)胞生長增殖有明顯的抑制作用；NCTD能引起JEG-3細(xì)胞G2期阻滯，其分子機制可

5、能是通過增加P21蛋白表達(dá)和下調(diào)CyclinB1蛋白而引起的。
　　2. NCTD能提升JEG-3細(xì)胞中ROS水平，同時細(xì)胞內(nèi)總的SOD酶活性降低，MDA含量升高。定量 PCR結(jié)果提示，抗氧化酶 SOD1、PRDX1、PRDX2、PRDX3以及細(xì)胞因子IL-6 mRNA表達(dá)隨著NCTD濃度的增加而降低，提示了NCTD作用JEG-3細(xì)胞，誘導(dǎo)ROS水平有可能是通過下調(diào)抗氧化物相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行的。
　　3通過Hochest332

6、58和DAPI染色、電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率及膜電位，結(jié)果提示了NCTD明顯誘導(dǎo)JEG-3細(xì)胞凋亡，同時細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)降低，而Bax、Fas、FasL蛋白表達(dá)增加
　　4.為了探索活性氧水平升高是NCTD誘導(dǎo)JEG-3細(xì)胞凋亡的主要原因，我們采用活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）與NCTD共同作用進(jìn)行反向求證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAC可逆轉(zhuǎn)NCTD誘導(dǎo)JEG-3細(xì)胞凋亡，其機制與NAC能降低Caspase-3、9

7、酶活性有關(guān)。
　　5.與單獨使用NCTD或5-FU比較，NCTD與5FU聯(lián)合使用，對JEG-3細(xì)胞具有更明顯的抑制效果，其機制與增加 Caspase-3、9酶活性相關(guān)。
　　6. NCTD對JEG-3細(xì)胞自噬影響的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，NCTD能誘導(dǎo) JEG-3細(xì)胞自噬，其機制與 mTOR、Akt、P62、LC3-Ⅱ及 Beclin1蛋白表達(dá)變化相關(guān)。為了進(jìn)一步論證自噬與活性氧的關(guān)系，我們用NAC與NCTD共同處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NA

8、C可以明顯減輕NCTD誘導(dǎo)的自噬，同時使自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62表達(dá)改變，結(jié)果提示了ROS升高是NCTD誘導(dǎo)JEG-3細(xì)胞自噬的主要原因。
　　結(jié)論：NCTD主要通過提高JEG-3細(xì)胞活性氧水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬，其機制可能與NCTD能改變JEG-3細(xì)胞內(nèi)的P21、CyclinB1、Fas、FasL、Bcl-2、Bax、 mTOR、P62、 Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)有關(guān)。另外，NCTD可以抑制JEG-3細(xì)胞增

9、殖，使細(xì)胞周期阻滯在G2期，可以對5-FU治療絨癌具有增敏作用。本實驗為NCTD治療人絨癌提供了重要的實驗依據(jù)，進(jìn)一步拓展了NCTD作為抗癌藥的應(yīng)用領(lǐng)域。
　　第二部分：NCTD對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移的影響，
　　目的：探討NCTD對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的增殖能力、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的影響及分子機制。
　　方法： MTT實驗檢測細(xì)胞增殖的變化，流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期變化，Annexin V

10、-FITC熒光雙染法檢測細(xì)胞凋亡，以及使用DAPI染色法檢測凋亡細(xì)胞形態(tài)。我們還使用相關(guān)試劑盒檢測細(xì)胞活性氧水平、膜電位、SOD、MDA及Caspase-3,-9酶活性變化。另外，我們使用小室實驗檢測細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，用劃痕修復(fù)法檢測細(xì)胞的遷移能力，Western-blot法檢測P21、CyclinB1、Fas、FasL、Bcl-2、Bax、VEGF、MMP-2、MMP-9等蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1. NCTD對A43

11、1細(xì)胞生長增殖有明顯的抑制作用，引起A431細(xì)胞 G2期阻滯。其分子機制可能是通過增加 P21蛋白表達(dá)和下調(diào)CyclinB1蛋白而引起的。
　　2. NCTD能升高ROS水平，誘導(dǎo)A431細(xì)胞凋亡率增加，同時細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)降低，而Bax、Fas、FasL蛋白表達(dá)增加。
　　3.為了探索是否由于活性氧水平升高誘導(dǎo)A431細(xì)胞凋亡，我們采用活性氧清除劑 N-乙酰半胱氨酸（NAC）與 NCTD共同作用。發(fā)現(xiàn)NAC可減少N

12、CTD誘導(dǎo)的凋亡，其機制與NAC能降低Caspase-3,9酶活性有關(guān)。提示NCTD通過增加ROS水平，誘導(dǎo)A431細(xì)胞凋亡。
　　5. Transwel小室、劃痕修復(fù)、黏附及Western-blot等實驗發(fā)現(xiàn)，NCTD對A431細(xì)胞的侵襲遷移和黏附能力均有明顯的抑制，其機制可能是與NCTD降低細(xì)胞內(nèi)的VEGF及MMP-2,-9蛋白表達(dá)水平有關(guān)。
　　結(jié)論：NCTD可明顯抑制A431細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，并且可以通過活性氧途