Melamine導(dǎo)致大鼠認(rèn)知損傷的機(jī)制研究和VC與VE聯(lián)用的可能治療.pdf

1、Melamine（1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺），是一種重要的化工原料，常被用來(lái)生產(chǎn)三聚氰胺樹脂與甲醛反應(yīng)，用于生產(chǎn)塑料、粘合劑和面料等。盡管在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，三聚氰胺被準(zhǔn)許可參與食品接觸產(chǎn)品（如食品包裝材料和餐具）的生產(chǎn)過(guò)程，但它不是食品添加劑，更沒(méi)有允許直接添加到食品中。
　　Melamine的毒理學(xué)研究起始于1984年。然而，當(dāng)時(shí)melamine的潛在毒性并沒(méi)有引起公眾的關(guān)注。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，嬰兒或動(dòng)物食用含mel

2、amine的食品后會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的損傷，其中腎臟是其作用的主要靶器官。本實(shí)驗(yàn)室以前的研究表明，melamine可能損害海馬錐體神經(jīng)元功能和誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其氧化損傷作用。顯然，melamine誘發(fā)的腎毒性并不能完全解釋其神經(jīng)毒性效應(yīng)。
　　另一方面，melamine引發(fā)的毒性報(bào)道逐漸減少。但仍然未知服用melamine后是否會(huì)影響嬰幼兒的中樞發(fā)育，甚至其毒性是否會(huì)影響成年后的認(rèn)知等。抗氧化劑能夠減少氧化應(yīng)激，并緩

3、解中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響。維生素C和維生素E是兩種重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。它們能及時(shí)分解自由基，抵御異常增加的自由基的攻擊，保護(hù)細(xì)胞正常的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。聯(lián)合使用維生素C和E能緩解阿爾茲海默癥、帕金森癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥以及共濟(jì)運(yùn)動(dòng)失調(diào)等誘發(fā)的氧化損傷、焦慮和認(rèn)知行為缺陷等，提高日常生活質(zhì)量。
　　基于以上研究背景，本實(shí)驗(yàn)主要探討慢性口服melamine對(duì)空間認(rèn)知和海馬突觸可塑性的影響。同時(shí)，檢測(cè)海馬內(nèi)自由基和抗氧化酶活性的變化。最后，

4、通過(guò)服用抗氧化維生素C和E對(duì)melamine引起的氧化損傷進(jìn)行恢復(fù)性治療，并探討其可能機(jī)制。
　　第一部分Melamine對(duì)空間認(rèn)知和海馬突觸可塑性的影響
　　目的:探討melamine對(duì)Wistar大鼠的空間認(rèn)知能力和海馬突觸可塑性的影響，并進(jìn)一步揭示其可能的生理機(jī)制。
　　材料與方法:大鼠隨機(jī)分成兩組:正常對(duì)照組(n=16)和Melamine(n=16)組。采用口服方式給予大鼠melamine懸濁液，每日一次。28

5、天后，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)melamine對(duì)大鼠的空間認(rèn)知能力的影響，包括學(xué)習(xí)、記憶和再獲取能力。記錄大鼠海馬Schaffer側(cè)枝到CA1區(qū)的突觸傳遞可塑性變化，包括LTP和LTD。采用酶標(biāo)法檢測(cè)口服melamine后大鼠海馬內(nèi)melamine含量變化。
　　結(jié)果:
　　1、ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示:大鼠口服melamine28天后，海馬內(nèi)melamine含量異常增加，說(shuō)明melamine能夠通過(guò)血腦屏障，并在海馬內(nèi)

6、積累。
　　2、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示:在學(xué)習(xí)和再獲取學(xué)習(xí)階段，melamine損傷大鼠逃避潛伏期明顯增加;在空間探索階段，目標(biāo)象限停留時(shí)間比率和穿越目標(biāo)平臺(tái)次數(shù)也明顯減少。說(shuō)明慢性口服melamine能損傷大鼠空間認(rèn)知能力，包括學(xué)習(xí)，參考記憶和再獲取能力。
　　3、電生理記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:服用melamine后，LTP實(shí)驗(yàn)記錄的場(chǎng)電位斜率明顯低于正常組;而LTD實(shí)驗(yàn)記錄的場(chǎng)電位斜率明顯高于正常組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明長(zhǎng)期口服m

7、elamine會(huì)導(dǎo)致大鼠海馬突觸可塑性的損傷。
　　結(jié)論:melamine能夠通過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦，并在海馬腦區(qū)積累。Melamine導(dǎo)致海馬長(zhǎng)時(shí)程突觸可塑性損傷，最終導(dǎo)致認(rèn)知能力，特別是認(rèn)知彈性損傷。
　　第二部分Melamine導(dǎo)致大鼠空間認(rèn)知損傷與誘發(fā)海馬氧化應(yīng)激相關(guān)
　　目的:為證實(shí)melamine導(dǎo)致空間認(rèn)知損傷是否與破壞海馬內(nèi)氧化與抗氧化穩(wěn)態(tài)相關(guān)。
　　方法:大鼠分為正常對(duì)照組(n=8)和Melami

8、ne（n=8）組。采用口服方式給予大鼠melamine懸濁液，每日一次。28天之后，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了melamine對(duì)空間認(rèn)知能力的影響以及海馬內(nèi)自由基、MDA、SOD和ATP水平。
　　結(jié)果:
　　1、慢性口服melamine4周中，大鼠體重增加量明顯減少。同時(shí)，海馬內(nèi)melamine濃度異常增加。
　　2、水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示:在學(xué)習(xí)階段，melamine損傷大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，在空間記憶階段，其

9、目標(biāo)象限停留百分比和目標(biāo)平臺(tái)穿越次數(shù)均明顯減少。
　　3、組織學(xué)HE染色結(jié)果表明:melamine導(dǎo)致海馬神經(jīng)元染色明顯加深，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞松散，細(xì)胞質(zhì)減少，出現(xiàn)大量壞死現(xiàn)象。
　　4、生化檢測(cè)試驗(yàn)表明:慢性口服melamine會(huì)增加海馬內(nèi)自由基、MDA和ATP含量，同時(shí)降低抗氧化酶活性，如SOD和GSH-Px。
　　結(jié)論:Melamine在海馬的神經(jīng)毒性與氧化應(yīng)激有關(guān)。
　　第三部分VC與VE聯(lián)合對(duì)melam

10、ine導(dǎo)致的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的恢復(fù)作用
　　目的:探討單獨(dú)使用VC、VE或聯(lián)合使用vitamin對(duì)melamine在PC12細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激的恢復(fù)作用。
　　方法:利用PC12細(xì)胞建立離體melamine損傷模型。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡和胞內(nèi)自由基數(shù)目。通過(guò)Hoechst33342染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。生化檢測(cè)抗氧化酶系統(tǒng)在恢復(fù)前后的改變。
　　結(jié)果:
　　1、Me

11、lamine損傷后，單獨(dú)使用VC、VE或聯(lián)合使用vitamin均能一定程度上恢復(fù)細(xì)胞存活率，但聯(lián)合使用維生素更具有優(yōu)勢(shì)。
　　2、聯(lián)合維生素能有效地減少自由基的異常積累，降低MDA水平，幫恢復(fù)抗氧化酶活性，如SOD，CAT和GSH-Px。
　　3、Hoechst33342染色和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法結(jié)果顯示:melamine能明顯誘發(fā)細(xì)胞凋亡，并且聯(lián)合vitamin能有效減少凋亡細(xì)胞數(shù)目。
　　4、聯(lián)合使用vitamin通過(guò)抑

12、制caspase-3活性抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　結(jié)論:聯(lián)合VC和VE能有效降低melamine誘發(fā)的氧化損傷，并抑制細(xì)胞凋亡。
　　第四部分VC與VE聯(lián)用對(duì)melamine誘發(fā)的認(rèn)知損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　目的:探討聯(lián)合使用VC和VE對(duì)melamine損傷大鼠認(rèn)知功能的恢復(fù)作用及其機(jī)制，包括氧化損傷和海馬突觸可塑性。
　　材料與方法:三周雄性大鼠隨機(jī)分成四組:正常對(duì)照組(n=16)，melamine（n=

13、16），melamine+vitamin組(n=16)和vitamin組(n=16)。采用口服方式給予melamine懸濁液，每日一次，建立melamine損傷動(dòng)物模型。隨后，給予一周聯(lián)合維生素C和E，腹腔注射每日一次。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了大鼠空間認(rèn)知能力變化。組織學(xué)HE染色觀察海馬錐體神經(jīng)元形態(tài)變化。記錄大鼠海馬Schaffer側(cè)枝到CA1區(qū)的突觸可塑性變化，包括LTP和LTD。采用酶標(biāo)法檢測(cè)大鼠海馬內(nèi)自由基、MDA、NO和抗

14、氧化劑和凋亡相關(guān)酶活性的變化等。
　　結(jié)果:
　　1、聯(lián)合使用VC和VE能恢復(fù)大鼠空間認(rèn)知損傷，包括能有效的改善學(xué)習(xí)和參考記憶能力，并一定程度上緩解再學(xué)習(xí)能力。
　　2、組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn):聯(lián)合vitamin能有效減少melamine導(dǎo)致的細(xì)胞壞死等損傷。
　　3、電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:melamine會(huì)導(dǎo)致大鼠海馬突觸長(zhǎng)時(shí)程可塑性的損傷。
　　聯(lián)合使用viatamin能緩解海馬突觸可塑性損傷，包括LTP和LTD

15、。
　　4、Melamine損傷大鼠注射VC和VE后，海馬中自由基、MDA和NO含量恢復(fù)到正常水平。SOD、CAT、GSH-Px和NOS的活性也明顯提高。神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和caspase-3的活性也明顯提高。
　　結(jié)論:聯(lián)合VC和VE通過(guò)干預(yù)氧化損傷過(guò)程，降低melamine誘發(fā)的神經(jīng)毒性，為治愈melamine導(dǎo)致的認(rèn)知損傷提供了新的可能依據(jù)。
　　第五部分慢性孕期酒精導(dǎo)致大鼠性別二態(tài)性的空間認(rèn)知和突觸可

16、塑性平衡損傷
　　目的:探討孕期酒精性別二態(tài)性的認(rèn)知行為變化，應(yīng)用突觸可塑性平衡探討空間認(rèn)知損傷的機(jī)制。
　　材料與方法:母鼠在妊娠期口服酒精并選取其雌雄后代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。出生后36天后代大鼠進(jìn)行MWM實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)其空間認(rèn)知功能變化，記錄其海馬Schaffer側(cè)枝到CA1區(qū)的突觸可塑性變化。用方向指數(shù)衡量雌雄大鼠突觸可塑性平衡的差異，進(jìn)一步揭示其性別二態(tài)性。
　　結(jié)果:
　　1、CPEE使后代大鼠體重增加明顯減少，同時(shí)

17、導(dǎo)致頭小畸形和海馬重量減輕。
　　2、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示:CPEE后代大鼠的逃避潛伏期明顯增加，并且其趨壁性明顯增多。在探索階段，CPEE后代大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比和目標(biāo)平臺(tái)穿越次數(shù)均明顯減少。此外，雌性后代比雄性后代認(rèn)知損傷更嚴(yán)重。
　　3、電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:CPEE導(dǎo)致雄性后代LTP明顯降低而去增益明顯增強(qiáng);而雌性LTP明顯增強(qiáng)而去增益明顯減弱。此外，雌性后代的損傷程度更嚴(yán)重。
　　4、方向指數(shù)進(jìn)一