VSTM1-V2在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中的功能研究.pdf

1、機體固有免疫系統(tǒng)在宿主防御中發(fā)揮重要作用，中性粒細胞和單核/巨噬細胞是固有免疫系統(tǒng)中最重要的效應(yīng)細胞。機體感染后他們立即激活并募集到感染部位，識別、吞噬和清除入侵病原體，同時分泌促炎介質(zhì)，募集其他免疫細胞到達感染部位，激活機體適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。但是在清除病原體同時，也可能因免疫反應(yīng)過度，導致嚴重的組織損傷，甚至引起致死性敗血癥休克，導致宿主死亡。免疫系統(tǒng)依靠多重機制調(diào)節(jié)這些過量激活的免疫反應(yīng)，其中一個重要的機制是免疫細胞自身表達抑制性受體

2、，抑制自身活性，平衡免疫反應(yīng)。
　　抑制性受體是免疫細胞上廣泛存在的一類免疫反應(yīng)負向調(diào)節(jié)器，這些受體與相應(yīng)配體結(jié)合后，經(jīng)由受體胞漿內(nèi)尾部的免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIMs）向細胞轉(zhuǎn)導抑制性信號，抑制細胞活性或提高細胞激活的閾值。這些抑制性受體在細胞吞噬、遷移、凋亡以及細胞因子產(chǎn)生等多方面調(diào)節(jié)免疫細胞活性，控制免疫應(yīng)答。人類基因組中有3

3、00多個潛在的能夠編碼ITIMs的基因，其編碼分子可能參與免疫細胞調(diào)控，但目前功能明確的只有1/5，大多數(shù)基因及其編碼分子的功能仍不清楚，V組跨膜結(jié)構(gòu)域包含物1（V-set and transmembrane domain containing1，VSTM1）正是其中之一。
　　目前關(guān)于VSTM1的功能報道很少。對其表達譜和DNA序列分析發(fā)現(xiàn)，VSTM1至少存在5種剪切體，VSTM1-V1～V5，其中VSTM1-V1和VSTM1-

4、V2是主要表達形式。VSTM1-V1在正常組織和細胞中廣譜表達，VSTM1-V2主要表達于免疫系統(tǒng)。VSTM1-V1為Ⅰ型膜蛋白，也稱為白細胞信號抑制性受體-1（signal inhibitoryreceptor on leukocytes-1，SIRL-1），主要表達于人中性粒細胞和單核細胞上，其胞漿內(nèi)尾部帶有ITIMs，因此是一個潛在的天然免疫反應(yīng)的抑制性受體，VSTM1-V2為經(jīng)典分泌的糖蛋白，除了沒有跨膜結(jié)構(gòu)外，與VSTM1-V

5、1序列完全一致，二者配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域完全一致，因此考慮VSTM1-V2與VSTM1-V1可能競爭結(jié)合配體。研究發(fā)現(xiàn)VSTM1-V1對巨噬細胞功能有抑制作用，而VSTM1-V2蛋白能促進外周血CD4+T細胞分泌IL-17A，也能促進初始CD4+T細胞向Th17細胞分化，而且在某些類風濕性關(guān)節(jié)炎患者血清中表達水平明顯升高，因此可能與自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。目前對VSTM1-V2的研究是在適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)方面，VSTM1-V2對固有免疫調(diào)

6、節(jié)作用仍然未知。
　　[目的]通過體外炎癥相關(guān)細胞培養(yǎng)以及急性炎癥小鼠模型建立，研究VSTM1-V2在機體固有免疫尤其是抗病原體感染免疫中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用。
　　[方法]體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)和人單核細胞系THP-1細胞，以細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或腫瘤壞死因子（Tumor necrosis fac

7、tor, TNF）-α作為陽性刺激物激活培養(yǎng)細胞。細胞分為正常對照(PBS)組、陽性刺激(TNF-α/LPS)組、不同濃度蛋白(VSTM1-V2)處理組、刺激物+不同濃度蛋白(TNF-α/LPS+ VSTM1-V2)刺激組。MTT實驗檢測VSTM1-V2蛋白對HUVECs或THP-1細胞增殖的影響;劃痕實驗檢測VSTM1-V2蛋白對HUVECs遷移的影響;測定細胞培養(yǎng)上清MPO活性和NO水平，明確VSTM1-V2蛋白對HUVECs或TH

8、P-1細胞活性的影響;RT-PCR檢測VSTM1-V1和VSTM1-V2基因在HUVECs中的轉(zhuǎn)錄情況以及VSTM1-V2蛋白對HUVECs或THP-1細胞的促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等）、趨化因子(IL-8、MCP-1、CXCL2等)以及細胞表面黏附分子(VCAM-1)的轉(zhuǎn)錄水平的影響;ELISA方法檢測VSTM1-V2蛋白對HUVECs或THP-1細胞培養(yǎng)上清中炎癥介質(zhì)表達和分泌的影響;Western bloting

9、方法檢測VSTM1-V2蛋白對HUVECs或THP-1細胞表達黏附分子（VCAM-1）、炎癥因子(IL-6)以及細胞內(nèi)信號分子JNK1和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(P65)的蛋白水平的表達，探討VSTM1-V2可能的細胞內(nèi)作用機制。以肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae，Kp)氣管內(nèi)注射方法建立小鼠急性肺炎模型，尾靜脈給予VSTM1-V2蛋白，實驗小鼠分為正常（Normal）組、Kp組和Kp+VSTM1-V2組，設(shè)6h和1

10、2h兩個時間點，在不同時間點采血、分離肺組織，HE染色觀察VSTM1-V2蛋白對急性肺炎的影響，肺組織提取總RNA，real-time qPCR方法檢測細胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α、CXCR2和MIP-2）表達，肺組織勻漿檢測MPO及iNOS活性;流式細胞術(shù)微球陣列法檢測VSTM1-V2蛋白對血清細胞因子（TNF-α、IL-6、MCP-1、和IL-10）的影響。
　　[結(jié)果](1) HUVECs中有VSTM1-V1和

11、VSTM1-V2表達，但表達量很低;TNF-α作用后VSTM1-V2表達相對VSTM1-V1增加，可能降低了由VSTM1-V1維持的細胞活化閾值，有利于細胞活化;VSTM1-V2刺激細胞后，VSTM1-V1相對VSTM1-V2增加更明顯，細胞可能因活化閾值升高，活性被抑制;VSTM1-V2預處理后，再用TNF-α刺激，發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激并沒有明顯改變VSTM1-V1和VSTM1-V2基因轉(zhuǎn)錄水平的比例;(2)HUVECs染色結(jié)果顯示VS

12、TM1-V2作用24h后，細胞數(shù)量明顯少于PBS對照組，VSTM1-V2處理HUVECs48h后的MTT結(jié)果也顯示，VSTM1-V2對HUVECs的生長有明顯的抑制作用;(3)利用劃痕實驗檢測VSTM1-V2對HUVECs遷移影響，結(jié)果顯示與TNF-α單獨作用組相比，VSTM1-V2與TNF-α聯(lián)合作用24h后，對TNF-α誘導的HUVECs遷移有明顯抑制作用，VSTM1-V2單獨作用對HUVECs也有抑制作用;利用RT-PCR和Wes

13、ternblotting方法檢測HUVECs上黏附分子VCAM-1的表達，發(fā)現(xiàn)TNF-α可以促進HUVECs的表達，但這種作用被VSTM1-V2抑制;(4) RT-PCR檢測IL-6、MCP-1、IL-8和CXCL2的mRNA表達，結(jié)果顯示給予TNF-α刺激后，HUVECs表達的促炎因子和趨化因子mRNA水平均升高，但VSTM1-V2可以降低TNF-α誘導的HUVECs趨化因子的產(chǎn)生，但對促炎因子IL-6作用不明顯;ELISA檢測也發(fā)現(xiàn)

14、，TNF-α作用后趨化因子CXCL2表達增加，但可以被VSTM1-V2抑制，Westernblotting檢測IL-6的表達也有相同的表現(xiàn);(5)檢測VSTM1-V2作用后的HUVECs的NO產(chǎn)生，結(jié)果顯示，VSTM1-V2與TNF-α共刺激HUVECs后，增加了NO的產(chǎn)生，提示VSTM1-V2對HUVECs的NO產(chǎn)生有影響;(6) Western blotting方法檢測VSTM1-V2作用后HUVECs內(nèi)NF-κB(P65)和MAP

15、K8(JNK1)表達變化，結(jié)果表明TNF-α誘導后P65和JNK1的增加都被VSTM1-V2所抑制，提示VSTM1-V2對TNF-α誘導的HUVECs活化的抑制作用，與NF-κB或MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)，可能通過抑制轉(zhuǎn)錄因子P65和信號調(diào)節(jié)分子JNK1對HUVECs進行調(diào)節(jié);(7)小鼠Kp急性肺炎模型中，HE染色后發(fā)現(xiàn)，VSTM1-V2對小鼠急性肺損傷有減輕或抑制作用;肺組織勻漿后，檢測MPO和iNOS活性，結(jié)果顯示給予VSTM1-V

16、2蛋白組小鼠肺組織MPO和iNOS活性都低于模型組小鼠，提示急性肺損傷模型小鼠肺組織有中性粒細胞浸潤且活性增強，而VSTM1-V2可以減弱這種損傷作用;(8) Real-time qPCR檢測肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α、CXCR2和MIP-2的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，Kp組各種炎癥因子表達水平遠遠高于正常組，而VSTM1-V2+Kp組與Kp組相比，各種炎癥因子表達都明顯降低(P＜0.01)，結(jié)果提示VSTM1-v2對

17、急性肺損傷小鼠肺組織各種炎癥因子有抑制作用;(9)流式細胞術(shù)微球陣列法檢測VSTM1-V2蛋白對血清細胞因子的影響，結(jié)果顯示與Kp組相比，VSTM1-V2+Kp組TNF-α、IL-6和MCP-1的各個時間點表達均降低(P＜0.05)，而IL-10各個時間點的表達均高于Kp組(P＜0.05)，結(jié)果提示Kp感染小鼠后，促炎細胞因子表達均升高，VSTM1-V2抑制了這些炎癥介質(zhì)的分泌;(10)但是VSTM1-V2對THP-1細胞的功能研究發(fā)現(xiàn)

18、相反的作用，VSTM1-V2不僅對THP-1細胞聚集或相互黏附以及增殖發(fā)揮促進作用，而且也能促進LPS對THP-1細胞的活化作用;此外對THP-1的MPO活性測定也發(fā)現(xiàn)，VSTM1-V2促進THP-1細胞的MPO活性，而且隨VSTM1-V2濃度的升高和時間的延長，THP-1的MPO活性增加，且上述作用可能與提高THP-1細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(P65)水平相關(guān)。
　　[結(jié)論](1) HUVECs上有VSTM1基因表達，TNF-α

19、刺激HUVECs可以提高細胞VSTM1-V2基因轉(zhuǎn)錄，降低細胞活化閾值，促進HUVECs活化;VSTM1-V2可以提高HUVECs的VSTM1-V1基因轉(zhuǎn)錄，提高細胞活化閾值，抑制HUVECs活化;(2) VSTM1-V2對體外培養(yǎng)的HUVECs增殖有抑制作用，也對TNF-α誘導的HUVECs遷移、黏附分子表達及細胞因子產(chǎn)生有抑制作用;VSTM1-V2抑制TNF-α誘導的HUVECs激活作用與細胞內(nèi)信號分子JNK1和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(