屎腸球菌HDRsEf1調(diào)節(jié)IPEC-J2細(xì)胞炎癥反應(yīng)機(jī)制研究.pdf

1、屎腸球菌是公認(rèn)的益生乳酸菌，具有改善宿主腸道健康、促進(jìn)生長(zhǎng)、降低腹瀉及免疫調(diào)節(jié)等作用。目前，有關(guān)屎腸球菌益生機(jī)理研究較少，尤其是其炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制。本論文通過(guò)體外試驗(yàn)，研究屎腸球菌HDRsEf1菌株對(duì)IPEC-J2細(xì)胞炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制。主要的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　試驗(yàn)1屎腸球菌HDRsEf1對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的影響。
　　(1)粘附試驗(yàn)。分別將HDRsEf1或者產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC) K88ac與培養(yǎng)10天后的IPE

2、C-J2細(xì)胞共孵育，檢測(cè)各自的粘附率。接下來(lái)檢測(cè)HDRsEf1菌體和其培養(yǎng)上清對(duì)K88ac粘附的影響。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下:IPEC-J2細(xì)胞與HDRsEf1和K88ac共孵育，或者IPEC-J2細(xì)胞先與HDRsEf1共孵育，再與K88ac共孵育，或者IPEC-J2細(xì)胞先與K88ac共孵育，再與HDRsEf1共孵育，分別檢測(cè)K88ac的粘附率。HDRsEf1培養(yǎng)上清(S-Ef1)對(duì)K88ac粘附的影響的操作和菌體類似。結(jié)果顯示HDRsEf1比K

3、88ac更易粘附于IPEC-J2細(xì)胞，且HDRsEf1菌體能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、排斥和置換作用阻止K88ac粘附IPEC-J2細(xì)胞，其粘附抑制率分別為46％(P＜0.05)，11％(P＜0.05)，61％(P＜0.05)，表明HDRsEf1置換致病菌的效果較好。此外，實(shí)驗(yàn)證明S-Ef1對(duì)K88ac的粘附幾乎沒(méi)有影響。
　　(2)屎腸球菌HDRsEf1對(duì)IPEC-J2細(xì)胞完整性的影響。IPEC-J2細(xì)胞培養(yǎng)10天后，能夠分化完全，形成完整的

4、膜結(jié)構(gòu)，可以開始試驗(yàn)。首先，我們用HDRsEf1及其S-Ef1預(yù)處理細(xì)胞2h，之后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，再加入K88ac，在3、6、12h測(cè)量其跨膜電阻(TEER)。結(jié)果顯示HDRsEf1及其S-Ef1能夠保護(hù)IPEC-J2細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，并能緩解K88ac對(duì)IPEC-J2細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞。
　　(3)屎腸球菌HDRsEf1對(duì)IPEC-J2細(xì)胞分泌IL-8的調(diào)節(jié)作用。首先，用HDRsEf1及其S-Ef1預(yù)處理細(xì)胞2h，之后更換

5、新鮮的完全培養(yǎng)基，再加入誘炎因子K88ac、IL-1β、TNF-α處理細(xì)胞，之后檢測(cè)IL-8的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDRsEf1及其S-Ef1都能夠緩解誘炎因子K88ac、IL-1β、TNF-α誘導(dǎo)的IL-8的表達(dá)。為了了解HDRsEf1發(fā)揮炎性調(diào)節(jié)作用的成分，將HDRsEf1及其S-Ef1加熱處理，并將其提取S-Ef1中的蛋白和胞外多糖，然后進(jìn)行抑炎試驗(yàn)。首先分別用滅活HDRsEf1、滅活S-Ef1、S-Ef1中蛋白、胞外多糖預(yù)處理IPEC

6、-J2細(xì)胞2h，之后加入K88ac作用2h。結(jié)果表明熱處理對(duì)HDRsEf1及S-Ef1的抑炎效果沒(méi)有影響，S-Ef1中的胞外多糖具有抑炎作用，而S-Ef1中的蛋白沒(méi)有抑炎作用。
　　試驗(yàn)2屎腸球菌HDRsEf1胞外多糖的分離純化:
　　試驗(yàn)證明HDRsEf1具有產(chǎn)胞外多糖的性能，將HDRsEf1接種在脫脂乳培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)30h，其精提胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)320mg/mL左右。將粗提胞外多糖用DEAE-Toyopearl650

7、M離子交換層析分離得到中性多糖(NPS)和酸性多糖(APS)，將NPS和APS分別經(jīng)過(guò)Sephadex G-100和Sepharose CL-6B純化，得到純的NPS和APS。
　　試驗(yàn)3 HDRsEf1及其胞外多糖調(diào)節(jié)IPEC-J2細(xì)胞炎癥反應(yīng)信號(hào)通路研究:
　　首先檢測(cè)HDRsEf1及其胞外多糖對(duì)細(xì)胞的毒性作用，證實(shí)HDRsEf1及其兩種多糖對(duì)IPEC-J2細(xì)胞沒(méi)有毒性，且都能提高IPEC-J2細(xì)胞的活性。接著，驗(yàn)證HD

8、RsEf1及其兩種多糖的炎癥調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示HDRsEf1及其兩種多糖都能緩解LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)。接下來(lái)，試驗(yàn)HDRsEf1及其兩種多糖是否通過(guò)TLR2和TLR4兩種受體發(fā)揮抑炎作用，以LPS誘導(dǎo)IPEC-J2炎癥模型，采用抗體中和試驗(yàn)TLR2和TLR4在HDRsEf1及其兩種多糖在炎癥調(diào)節(jié)中的作用，結(jié)果顯示，TLR2在HDRsEf1的炎癥調(diào)節(jié)中起重要的作用;TLR2和TLR4在兩種多糖的炎癥調(diào)節(jié)中都發(fā)揮重要的作用。為進(jìn)

9、一步弄清HDRsEf1及其兩種多糖對(duì)TLR的炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制，檢測(cè)了HDRsEf1和其兩種多糖對(duì)TLR信號(hào)通路中相關(guān)負(fù)調(diào)節(jié)因子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示TLR負(fù)調(diào)節(jié)因子Tolliop，IRAKM，A20，Bcl-3在HDRsEf1的炎性調(diào)節(jié)中起重要的作用;TLR負(fù)調(diào)節(jié)因子SIGIRR，Tolliop，IRAKM，A20，Bcl-3在NPS的炎性調(diào)節(jié)中起重要的作用;TLR負(fù)調(diào)節(jié)因子Tolliop，A20，Mkp-1在APS的炎性調(diào)節(jié)中起重要作用。最