microRNA-30e在膿毒癥急性肺損傷中的表達(dá)及其調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:1.探討膿毒癥大鼠受損肺組織及脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)miR-30e的表達(dá)及其與炎癥因子表達(dá)的相關(guān)性;
　　2.探討被上調(diào)或下調(diào)的miR-30e對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)發(fā)揮的作用;
　　3.初步探討上調(diào)或下調(diào)的miR-30e對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用的機(jī)制。
　　方法:1.建膿毒癥大鼠模型，觀察大鼠一般情況，采集肺組織標(biāo)本，分析肺組織病理結(jié)構(gòu)的變化，判斷模型是否構(gòu)建成功。用RT-q

2、PCR方法檢測膿毒癥大鼠肺組織中miR-30e和炎癥指標(biāo)的表達(dá)情況，并分析兩者的相關(guān)性;
　　2.構(gòu)建NR8383細(xì)胞（肺泡巨噬細(xì)胞）的膿毒癥模型，在LPS刺激的NR8383細(xì)胞0h、3h、6h、12h、24h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測miR-30e和炎癥因子表達(dá)水平的變化，并分析兩者的相關(guān)性;
　　3.采用microRNA靶基因預(yù)測軟件Targetscan和RNAhybrid數(shù)據(jù)庫對rno-miRNA-30e-5p進(jìn)行靶基因預(yù)測，以兩

3、個(gè)或以上軟件共同預(yù)測結(jié)果作為其候選靶基因。對miR-30e及靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測其結(jié)合位點(diǎn)及相關(guān)信號通路，在LPS處理的肺泡巨噬細(xì)胞中用Western Blot方法檢測靶蛋白的表達(dá);
　　4.將miR-30e mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染至NR8383細(xì)胞，用RT-qPCR方法檢測炎癥因子的mRNA水平的表達(dá)改變，ELISA法檢測炎癥因子的蛋白水平表達(dá)改變，并用Western Blot檢測靶蛋白的表達(dá);
　

4、　5.統(tǒng)計(jì)方法:用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，多組樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05，為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性檢驗(yàn)，當(dāng)雙變量都服從正態(tài)分布時(shí)采用Pearson相關(guān)分析，不服從時(shí)則采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.大鼠膿毒癥模型的建立及肺組織的病理改變。正常對照組大鼠一般情況良好，活動自如，呼吸平穩(wěn)

5、，飲食飲水未見異常，對外界刺激的反應(yīng)正常。LPS處理組大鼠在LPS注射后30分鐘開始出現(xiàn)躁動不安，心率、呼吸頻率顯著加快;LPS注射后3小時(shí)，呼吸急促癥狀明顯，四肢、唇鼻紫紺，體溫上升，并出現(xiàn)精神反應(yīng)差、蜷縮懶動、肌張力下降、不思飲食、嗜睡、豎毛、腹瀉、對外界刺激反應(yīng)減弱等內(nèi)毒素血癥表現(xiàn)，部分大鼠口鼻有紅色泡沫樣液體溢出。肺組織石蠟切片HE染色顯示:各膿毒癥組大鼠肺組織可見結(jié)構(gòu)破壞，肺泡膨脹不全、肺泡融合或塌陷，肺泡腔內(nèi)有滲出液;肺泡間

6、隔明顯增厚，可見大量炎性細(xì)胞浸潤;肺組織毛細(xì)血管擴(kuò)張、淤血，管腔內(nèi)充滿紅細(xì)胞，甚至有血栓形成，隨著膿毒癥炎癥損傷時(shí)間的延長，肺組織損傷程度不斷加重。
　　2.膿毒癥大鼠肺組織miR-30e、炎癥因子改變，及兩者之間的相關(guān)性。各膿毒癥組大鼠肺組織miR-30e表達(dá)水平相比正常對照組均明顯下調(diào)，且具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，其中模型組24h下調(diào)最明顯;膿毒癥組3h、6h、12h、24h IL-1β、TNF-α相對表達(dá)水平與正常

7、對照組相比均顯著上升(P＜0.01)，且在膿毒癥3h時(shí)達(dá)到最高峰，隨后開始下降，但與正常對照組相比仍然明顯上調(diào)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織中miR-30e與IL-1β水平呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.417，P=0.022)，與TNF-α水平也呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.437，P=0.016)。
　　3.LPS刺激NR8383細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中miR-30e、炎癥因子的表達(dá)改變，及兩者之間的相關(guān)性。LPS刺激3、6、12、24小時(shí)后

8、miR-30e表達(dá)水平相比空白對照組均明顯下調(diào)，且具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。其中LPS3h組下調(diào)最明顯;LPS刺激3、6、12、24小時(shí)后IL-1β、TNF-α相對表達(dá)水平相比空白對照組均顯著上升(P＜0.01)，且同膿毒癥大鼠肺組織結(jié)果一致，在LPS3h組時(shí)達(dá)到最高峰，隨后開始下降，但與空白對照組相比仍然明顯上調(diào)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS刺激NR8383細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中miR-30e的表達(dá)水平與IL-1β水平呈負(fù)相關(guān)性（r

9、=-0.713，P=0.003），與TNF-α水平也呈明顯負(fù)相關(guān)性(r=-0.712，P=0.002)。
　　4.miR-30e靶基因的預(yù)測及驗(yàn)證。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，miR-30e5'端種子區(qū)與Notch1 mRNA3'UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，提示Notch1基因很可能是miR-30e作用的靶基因，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。LPS刺激NR8383細(xì)胞6、12、24小時(shí)后細(xì)胞中Notch1蛋白含量灰度值均較LPS0h、LPS3h組

10、明顯上調(diào)，隨著刺激時(shí)間的延長，Notch1蛋白表達(dá)逐漸增加，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，LPS+miR-30e m組較LPS+NC m組Notch1蛋白的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=33.767，P＜0.01);LPS+miR-30e i組較LPS+NC i組Notch1蛋白的表達(dá)水平明顯升高，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-11.371，P＜0.01)，表明Notch1蛋白表達(dá)受到miR-30e的調(diào)控。
　　5.m

11、iR-30e對LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞NR8383炎癥反應(yīng)發(fā)揮的作用。LPS+miR-30e m組較LPS+NC m組TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)水平明顯降低(TNF-α:t=19.574，P＜0.01; IL-1β: t=3.477，P=0.025);與LPS+NC i組相比較，LPS+miR-30e i組TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)水平明顯升高(TNF-α:t=-6.606,P＜0.01; IL-1β: t=-3.45

12、7，P=0.026)。LPS+miR-30e m組較LPS+NC m組的TNF-α、IL-1β的蛋白表達(dá)水平明顯降低(TNF-α:t=5.899，P=0.004;IL-1β: t=5.107，P=0.007);而與LPS+NC i組相比較，LPS+miR-30e i組TNF-α、IL-1β的蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(TNF-α:t=-6.785，P=0.002; IL-1β: t=-3.662, P=0.022)。