基于SRAP技術(shù)的與紅花苞葉刺緊密相關(guān)基因的篩選及克隆.pdf

1、重要農(nóng)藝性狀基因緊密連鎖標(biāo)記的獲得，對于進(jìn)行性狀分子標(biāo)記輔助選擇，提高育種的選擇效率與預(yù)見性，加快新品種的選育進(jìn)程具有重要意義。紅花(Carthamus tinctorius L.)是為菊科1-2年生草本植物，在我國，多作藥用植物栽培，以花入藥，是重要的活血化瘀中藥。苞葉無刺是紅花的重要農(nóng)藝性狀，培育無刺品種是藥用紅花育種的重要目標(biāo)之一。因此，從DNA乃至cDNA水平研究與紅花苞葉刺緊密相關(guān)的基因，將為分子標(biāo)記輔助培育無刺紅花品種、加速

2、紅花育種進(jìn)程奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為從分子水平調(diào)控紅花品種提供有效途徑。 相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)是一種新型的基于PCR的標(biāo)記技術(shù)，該標(biāo)記通過獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對可讀框(openreading frames，ORFs)進(jìn)行擴(kuò)增。因個(gè)體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。該標(biāo)記將AFLP和RAPD兩種方法的優(yōu)點(diǎn)有機(jī)的結(jié)合起來，具有簡便、

3、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、便于克隆目標(biāo)片段的特點(diǎn)。 本研究采用分離體分組混合分析法(bulk segregate analysis，BSA)，以紅花雜交F<,2>代單株苞葉刺多而長、苞葉無刺的極端性狀為依據(jù)，構(gòu)建紅花苞葉有刺與無刺DNA、RNA兩個(gè)近等基因池。利用DNA-SRAP標(biāo)記技術(shù)，在基因池間篩選45對引物，通過親本及F<,2>代分離群體的單株驗(yàn)證，獲得與紅花苞葉刺性狀連鎖的1個(gè)SRAP標(biāo)記，命名為M3E3，經(jīng)測序，其精確長度為349

4、bp。進(jìn)一步，采用cDNA-SRAP方法，從表達(dá)水平探討與紅花苞葉刺相關(guān)的基因片段，通過60對引物對基因池進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，共有19對引物具有多態(tài)性帶型，在此基礎(chǔ)上，在親本和基因池中進(jìn)行共同篩選，引物Me3/Em4，Me5/Em2，Me3/Em6，Me2/Eml擴(kuò)增出多態(tài)性條帶SRAP-1、SRAP-2、SRAP-3、SRAP-4、SRAP-5和SRAP-6，表現(xiàn)出有刺親本、有刺池有特異帶，而無刺親本、無刺池?zé)o特異帶。通過F<,2>

5、代分離群體單株對SRAP-1、SRAP-2、SRAP-3、SRAP-4、SRAP-5和SRAP-6進(jìn)行驗(yàn)證并計(jì)算交換率。標(biāo)記SRAP-1、SRAP-2、SRAP-3和SRAP-4的交換率與有刺紅花之間具有較高的交換率，分別為32.9％，45.7％，35.7％和61.4％，說明標(biāo)記與紅花苞葉刺性狀不存在緊密連鎖關(guān)系；標(biāo)記SRAP-5、SRAP-6的交換率較低，分別為7.1％和4.3％，與紅花苞葉刺性狀緊密連鎖，為特異性cDNA片段，經(jīng)測序

6、，這2條片段的精確長度分別為278bp和150bp。 本研究將序列為278bp的片段命名為GPY-1，序列為150bp的片段命名為GPY-2。利用cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)，根據(jù)GPY-2的序列設(shè)計(jì)并合成引物，克隆全長cDNA。獲得了與紅花苞葉刺性狀緊密連鎖的GPY-2全長cDNA序列及其基因組序列。GPY-2的cDNA序列全長1679 bp(GenBa

7、nk Accession No：EF104641)，其含有一個(gè)1524bp的開放閱讀框(ORF)，編碼508個(gè)氨基酸殘基的蛋白。5'非翻譯區(qū)(untranslated regions)為80bp，3'非翻譯區(qū)為75bp。采用基因組DNA模板擴(kuò)增得到與此相同的條帶，測序結(jié)果與GPY-2全長cDNA序列亦完全一致，表明與GPY-2全長cDNA對應(yīng)的基因組序列中不存在內(nèi)含子。序列分析結(jié)果表明GPY-2的氨基酸序列與葉綠體基因組ATP合酶CF1