羥基紅花黃色素A動態(tài)積累規(guī)律研究及相關基因的克隆.pdf

1、本研究采用HPLC法，研究紅花羥基紅花黃色素A積累規(guī)律，結(jié)果表明，紅花HSYA在花蕾形成時期就開始產(chǎn)生并積累，在開花第三天時候，其含量到達平臺期，其動態(tài)積累規(guī)律符合指數(shù)曲線數(shù)學模型；并對雜交F2代植株的羥基紅花黃色素A(HSYA)含量測定，F(xiàn)1代各植株均含羥基紅花黃色素A，F(xiàn)2代植株部分含羥基紅花黃色素A含量為2.0％以上，部分羥基紅花黃色素A含量為0％，產(chǎn)生了性狀分離。為尋找控制羥基紅花黃色素A質(zhì)量性狀緊密連鎖的基因(命名為HSya)

2、，使用AFLP分子標記技術(shù)。建立紅花cDNA-AFLP反應體系，結(jié)合群體混合分離分析策略(BSA)以及聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和銀染法，根據(jù)HPLC對HSYA含量的測定結(jié)果，以F2代含羥基紅花黃色素A與不含羥基紅花黃色素A的極端植株構(gòu)建了品質(zhì)性狀的兩個近等基因池，從表達水平篩選與羥基紅花黃色素A相關的差異表達片段(TDF)。用多對引物組合篩選基因池得到差異表達片段，經(jīng)過F2代單株驗證，以及RT-PCR表達分析驗證后，篩選出具有多態(tài)

3、性的兩組引物，得到2條與紅花高品質(zhì)性狀(含黃色素A)緊密連鎖的特異性TDF片段分別命名為TDF-A、TDF-C，經(jīng)測序及統(tǒng)計遺傳距離，這2條片段的精確長度分別為478bp、150bp，遺傳距離分別為8.1cM和2.1cM。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，TDF-A片段與毛果楊的一個預測蛋白mRNA序列有同源性，TDF-C與擬南芥的17.66 kDa第一族小分子量熱休克蛋白的mRNA序列有高度同源性(＞85％)。用RACE技術(shù)進行TDF-C片段的全長

4、基因擴增，經(jīng)過拼接測序，得到697bp的全長基因，編碼了136個氨基酸，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)該全長編碼的蛋白與多個植物中的熱休克蛋白有同源性。熱休克蛋白在植物中不僅是一種在應激的條件下啟動表達的產(chǎn)物，也有分子伴侶的功能，可能影響到某些蛋白空間結(jié)構(gòu)，直接或間接影響到某些酶的活性或濃度，可能會影響植物次生代謝物的生物合成或積累。推測該蛋白的表達可能影響到紅花中HSYA合成途徑某個或某些活性蛋白的活性，進而影響了HSYA在紅花中的產(chǎn)生及積累。