兩親性殼聚糖連接低分子量聚乙烯亞胺為骨架的腫瘤靶向轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建.pdf

1、基因治療的本質(zhì)是通過基因?qū)胂到y(tǒng)將外源基因?qū)氚屑?xì)胞,通過遺傳或分子生物學(xué)技術(shù)糾正或補(bǔ)償基因缺陷和異常,以達(dá)到治療疾病的目的。作為一種新的治療手段,基因治療可以克服包括腫瘤、遺傳性疾病、心血管疾病和自身免疫缺陷等多種疾病,目前研究主要集中于腫瘤的治療?；蛑委煹年P(guān)鍵是選擇安全且高效的轉(zhuǎn)基因載體,使目的基因高效作用于特定細(xì)胞且細(xì)胞毒性較小。轉(zhuǎn)基因載體有病毒型和非病毒型兩種。聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)因其結(jié)構(gòu)中

2、含有多種氨基,質(zhì)子化后含豐富電荷而成為研究最為廣泛的一種聚陽離子型非病毒轉(zhuǎn)基因載體。然而PEI應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因載體尚存在三個(gè)突出問題:第一,轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞毒性存在矛盾:高分子量 PEI轉(zhuǎn)染效率高,但細(xì)胞毒性大;低分子量PEI細(xì)胞毒性小,但轉(zhuǎn)染效率低。第二,體液穩(wěn)定性與穿膜能力存在矛盾:通過增加親水性來增加PEI體液穩(wěn)定性將會(huì)降低PEI的穿膜能力,而不利于目的基因遞送。第三,PEI的細(xì)胞靶向性差。由于PEI是靠靜電相互作用與細(xì)胞結(jié)合,因此無法

3、識(shí)別并作用于特定細(xì)胞。
　　殼聚糖(Chitosan, CS)是一種天然高分子化合物,由甲殼類動(dòng)物的甲殼素脫乙酰基后得到,具有高生物相容性和低細(xì)胞毒性,也被用作轉(zhuǎn)基因載體。但殼聚糖在生理?xiàng)l件下溶解度低,且表面電荷少,使其轉(zhuǎn)染效率低,限制了其作為轉(zhuǎn)基因載體的應(yīng)用。
　　整合素是細(xì)胞表面受體的主要家族,對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的粘附起介導(dǎo)作用。整合素是由α(120-185kDa)和β(90-110kDa)兩個(gè)亞單位形成的異二聚體,已發(fā)

4、現(xiàn)20余種,其中整合素αvβ3在多種腫瘤表面和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá),對(duì)腫瘤血管的生成起著重要作用,因此,整合素αvβ3成為抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)。
　　基于以上分析,本課題首先對(duì)殼聚糖 CS進(jìn)行改性,得到兩親性殼聚糖 N-辛基-N-季銨化殼聚糖OTMCS,然后以其連接低分子量PEI(PEI2KDa),得到高分子量聚乙烯亞胺衍生物OTMCS-PEI。同時(shí)將特異親和整合素αvβ3的RGD肽與細(xì)胞穿膜肽 TAT(49-57)偶聯(lián),形成

5、具有靶向于腫瘤細(xì)胞和提高穿膜效率的雙功能肽RGDC-TAT(命名為R13)。最后,采用雙功能肽R13修飾PEI衍生物OTMCS-PEI,得到新型轉(zhuǎn)基因載體OTMCS-PEI-R13。
　　本文第一章介紹了聚乙烯亞胺與殼聚糖在轉(zhuǎn)基因載體中的應(yīng)用,包括聚乙烯亞胺的結(jié)構(gòu)特性、對(duì)其進(jìn)行不同的修飾得到的各種聚乙烯亞胺衍生物以及殼聚糖的結(jié)構(gòu)特性、研究熱點(diǎn)等。
　　第二章內(nèi)容為OTMCS-PEI-R13的合成與表征。首先采用固相法制備雙功

6、能肽R13,并通過質(zhì)譜測(cè)定其序列,HPLC測(cè)定其相對(duì)含量,并采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè) R13與整合素αvβ3陽性的Hela細(xì)胞和 B16細(xì)胞的親和能力。殼聚糖CS依次與正辛醛、N-甲基吡咯烷酮在一定條件下反應(yīng)得到兩親性殼聚糖N-辛基-N-季銨化殼聚糖OTMCS,進(jìn)而采用三光氣+琥珀酰亞胺法活化OTMCS并與PEI2KDa連接形成 OTMCS-PEI高分子量衍生物。最后通過交聯(lián)劑 SMCC將 R13按不同摩爾比與OTMCS-PEI偶聯(lián)得到最終產(chǎn)

7、物OTMCS-PEI-R13。各反應(yīng)產(chǎn)物通過IR或1HNMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明,成功合成了雙功能肽R13,其純度達(dá)到95％,同時(shí),R13表現(xiàn)出良好的腫瘤細(xì)胞親和能力。成功合成了兩親性殼聚糖 OTMCS,并采用三光氣+琥珀酰亞胺法活化 OTMCS并交聯(lián) PEI2KDa,最后成功采用 SMCC法將 R13與OTMCS-PEI偶聯(lián)形成最終產(chǎn)物 OTMCS-PEI-R13。紅外、核磁等結(jié)構(gòu)表征表明目的產(chǎn)物修飾度高且純度好,說明合成方法穩(wěn)定、

8、可控。
　　本文第三章考察了OTMCS-PEI和OTMCS-PEI-R13的理化性質(zhì)。通過測(cè)定兩種聚合物在37℃下不同時(shí)間點(diǎn)分子量來評(píng)價(jià)其水解性能;使用激光粒度儀和 Zeta電位測(cè)定儀測(cè)定其粒徑及表面電位;使用透射電鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu);通過凝膠電泳阻滯分析考察其包裹DNA的能力及對(duì)DNA的保護(hù)能力;采用 MTT法評(píng)價(jià)兩種聚合物對(duì)Hela細(xì)胞、B16細(xì)胞的毒性,并與PEI25KDa和PEI2KDa進(jìn)行比較。結(jié)果表明,OTMCS-PEI

9、-R13在37℃條件下可緩慢水解,大約60小時(shí)水解為小分子聚合物。與DNA形成的復(fù)合物呈類球形,粒徑約150-250 nm,電位適中。OTMCS-PEI與DNA質(zhì)量比為0.6時(shí)可將 DNA完全包裹, OTMCS-PEI-R13-l與DNA質(zhì)量比為1時(shí)將DNA完全包裹,OTMCS-PEI-R13-h與DNA質(zhì)量比為3時(shí)將DNA完全包裹,三者均具有較強(qiáng)DNA縮合能力。同時(shí), OTMCS-PEI可保護(hù)DNA抵抗1100μg/mL肝素鈉、3 U

10、 DNase I/μg DNA的DNase I及50%血清的解離,OTMCS-PEI-R13可保護(hù)DNA抵抗300μg/mL肝素鈉、23.5 U DNase I/μg DNA的DNase I及50%血清的解離。以上結(jié)果表明OTMCS-PEI和OTMCS-PEI-R13均具有很強(qiáng)的DNA保護(hù)能力。與高分子量PEI(PEI25 KDa)相比,OTMCS-PEI與OTMCS-PEI-R13的細(xì)胞毒性顯著降低,低濃度時(shí)與PEI2KDa毒性類似,

11、即使在高濃度時(shí)仍保持60%以上細(xì)胞活度。
　　本文第四章考察了 OTMCS-PEI/DNA、OTMCS-PEI-R13-l/DNA及OTMCS-PEI-R13-h/DNA復(fù)合物體內(nèi)外轉(zhuǎn)染。以pEGFP-N2綠色熒光蛋白質(zhì)粒和pGL3-Control蟲熒光素酶質(zhì)粒為報(bào)告基因,考察兩種復(fù)合物在Hela細(xì)胞和B16細(xì)胞中的體外轉(zhuǎn)染能力。熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況,生物/化學(xué)發(fā)光儀定量檢測(cè)蟲熒光素酶表達(dá)情況。最后建立腫瘤模型,

12、以 pGL3-Control蟲熒光素酶質(zhì)粒作為報(bào)告基因,考察復(fù)合物在體內(nèi)的分布和表達(dá)情況。結(jié)果表明,隨著w/w升高,轉(zhuǎn)染效率也逐漸升高,三種復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率均顯著高于PEI25 KDa,尤其連接R13后,轉(zhuǎn)染效率更大幅提高。體內(nèi)試驗(yàn)表明,復(fù)合物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率同樣優(yōu)于PEI25 KDa,偶聯(lián)R13后,蟲熒光素酶報(bào)告基因在腫瘤組織中表達(dá)增強(qiáng),表明R13可明顯改善復(fù)合物在體內(nèi)的分布,可知OTMCS-PEI-R13在體內(nèi)具有較強(qiáng)腫瘤靶向能力。