環(huán)糊精偶聯(lián)低分子量聚乙烯亞胺構(gòu)建新型非病毒轉(zhuǎn)基因載體及其應(yīng)用.pdf

1、基因治療是將人正常的或有治療作用的基因通過一定方式導(dǎo)入靶細(xì)胞來干預(yù)疾病的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)程,包括替代或糾正人自身基因結(jié)構(gòu)或功能上的缺陷或錯誤,殺滅病變的細(xì)胞或增強(qiáng)機(jī)體清除病變細(xì)胞的能力等,從而達(dá)到治療的目的.現(xiàn)在基因治療已經(jīng)進(jìn)行了較多的研究,并且有一些研究已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段. 在目前腫瘤的基因治療中,阻礙基因成功轉(zhuǎn)移的一個主要原因是缺乏較強(qiáng)靶向腫瘤細(xì)胞或組織能力的轉(zhuǎn)基因載體體系.為了提高轉(zhuǎn)基因載體的靶向性,選擇能與腫瘤特異性靶點(diǎn)

2、特異結(jié)合的靶向物來修飾轉(zhuǎn)基因載體顯得非常重要.在人類20-30﹪乳腺癌和部分卵巢癌的細(xì)胞中,Her-2受體過度表達(dá),目前有一些研究利用針對Her-2受體的曲妥珠單抗與非病毒載體偶聯(lián),以提高非病毒轉(zhuǎn)基因載體靶向Her-2受體陽性腫瘤細(xì)胞的能力.但是抗體是較大的蛋白質(zhì),不宜重復(fù)給藥.所以本研究考慮使用可以與Her-2受體特異結(jié)合的靶向性的寡肽與新型非病毒載體偶聯(lián),本研究根據(jù)文獻(xiàn)報道,在噬菌體展示技術(shù)篩選得到的寡肽中選擇了一條能與Her-2受

3、體特異結(jié)合的高親和力寡肽(其氨基酸序列是Met-Ala-Arg-Ala-Lys-Glu),與新型載體連接,以提高載體與Her-2受體陽性腫瘤細(xì)胞或組織的特異結(jié)合能力.通過在一些Her-2受體陽性的乳腺腫瘤和卵巢腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因試驗,最終研制出一種新型的具有靶向性,低毒,可降解的高效率轉(zhuǎn)基因載體. 本研究分兩部分進(jìn)行: 第一部分,選擇了水溶性好低毒性的多羥基化合物羥丙基環(huán)糊精(HP α-CD,2-羥丙基α-環(huán)糊精;HP

4、 β-CD,2-羥丙基β-環(huán)糊精;HPγ-CD,2-羥丙基γ-環(huán)糊精)作為骨架,同時選擇了低毒性的多氨基化合物,即低分子量多聚乙烯亞胺(分枝狀PEI 600 Da.和線型的PEI 423 Da)作為支鏈,通過一種可以形成可降解酯鍵的試劑羰二咪唑(CDI)進(jìn)行連接形成新的共聚物,篩選出高效,低毒,可降解的新型載體. 第二部分,通過一段靶向寡肽與新型載體的偶聯(lián)(該寡肽可以與Her-2受體胞外段特異結(jié)合),從而使得新型載體具有一定靶

5、向能力,提高特異性.經(jīng)過體外體內(nèi)的試驗證實(shí)寡肽偶聯(lián)的新型載體具備了靶向到Her-2受體的腫瘤細(xì)胞的能力,提高了在靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因效率,新型載體攜帶α-干擾素的真核表達(dá)質(zhì)粒在荷瘤裸鼠的基因治療中顯示了較好的治療效果. 第一部分 羥丙基環(huán)糊精偶聯(lián)低分子量聚乙烯亞胺構(gòu)建新型非病毒轉(zhuǎn)基因載體 目的:選用羥丙基環(huán)糊精系列作為骨架偶聯(lián)低分子量PEI,以構(gòu)建新型可降解,低毒,高效率轉(zhuǎn)基因載體. 方法:選擇了多羥基化合物羥丙基環(huán)糊

6、精作為骨架,同時選擇了多氨基化合物低分子量PEI(分枝狀PEI 600 Da和線型的PEI 423 Da)作為支鏈,通過試劑羰二咪唑進(jìn)行連接形成多種新的共聚物,通過質(zhì)子核磁共振波譜法,紅外分光光度分析法,熱分析法等表征手段對新合成的共聚物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗證,并通過質(zhì)子核磁共振波譜法檢測新共聚物的環(huán)糊精和PEI的相對組成.通過檢測粒徑大小,表面電荷以及通過DNA凝膠電泳阻滯試驗來評估新共聚物縮合DNA的能力.通過MTT法檢測共聚物對不同細(xì)胞毒

7、性.以合成的共聚物為載體攜帶綠色熒光蛋白質(zhì)粒進(jìn)行多種細(xì)胞轉(zhuǎn)染,觀察細(xì)胞的綠色熒光,使用共聚物攜帶熒光素酶質(zhì)粒進(jìn)行多種細(xì)胞轉(zhuǎn)染,再用化學(xué)發(fā)光儀檢測熒光素酶與底物蛋白結(jié)合后顯示的相對熒光強(qiáng)度,評估轉(zhuǎn)染效率.并在有血清和無血清的培養(yǎng)液中,比較血清對載體的轉(zhuǎn)染效率的影響.在接近生理條件下進(jìn)行共聚物的可降解性檢測. 結(jié)論:合成得到了HP α-CD-PEI 600,HP β-CD-PEI 600,HP γ-CD-PEI600,HP β-CD

8、-PEI 423,HP γ-CD-PEI 423等多種新的共聚物.HP β-CD-PEI600,HP γ-CD-PEI 600縮合DNA的能力較強(qiáng).從中篩選出HP β-CD-PEI 600,HP γ-CD-PEI 600兩種較高轉(zhuǎn)染效率的新型載體.HPγ-CD-PEI 600達(dá)到最高轉(zhuǎn)基因效率的N/P比值較低,所以使用量小于HP α-CD-PEI 600和HPβ-CD-PEI 600.HP α-CD-PEI 600,HP β-CD-PE

9、I 600,HP γ-CD-PEI 600轉(zhuǎn)染細(xì)胞時,轉(zhuǎn)基因效率受血清影響較小,HP γ-CD-PEI 600轉(zhuǎn)基因效率受血清影響最小.因為HP γ-CD-PEI 600的轉(zhuǎn)基因效率高,用量小,在有血清培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)染效率下降最少,所以最終選擇了HP γ-CD-PEI 600進(jìn)行第二部分試驗.比較共聚物的不同組成和轉(zhuǎn)基因效率的關(guān)系,認(rèn)為PEI的接入量與共聚物縮合DNA的能力和轉(zhuǎn)基因的效率有直接的關(guān)系.新的共聚物中PEI的接入量高,共聚物縮

10、合DNA的能力強(qiáng),轉(zhuǎn)基因的效率也較高. 第二部分 提高新型載體靶向Her-2受體陽性細(xì)胞的能力 目的:將新型載體HP γ-CD-PEI 600與靶向寡肽偶聯(lián),使其具有靶向到Her-2受體陽性的乳腺腫瘤或卵巢腫瘤細(xì)胞的能力. 方法:根據(jù)文獻(xiàn)報道的通過噬菌體展示技術(shù)篩選出來,針對Her-2受體蛋白的一段高親和力寡肽(序列為MARAKE)做為配體通過試劑SPDP偶聯(lián)新型載體HP γ-CD-PEI 600.質(zhì)子核磁共振波

11、譜法驗證寡肽與新型載體的偶聯(lián).偶聯(lián)寡肽的載體攜帶綠色熒光蛋白質(zhì)粒及熒光素酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Her-2受體陽性細(xì)胞(卵巢癌SKOV-3c細(xì)胞,乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞和T 47D細(xì)胞)和Her-2受體陰性細(xì)胞(乳腺癌MCF-7細(xì)胞),用流式細(xì)胞儀檢測具有綠色熒光細(xì)胞百分率,化學(xué)發(fā)光儀檢測熒光素酶相對熒光強(qiáng)度,比較偶聯(lián)寡肽后與未偶聯(lián)寡肽載體的轉(zhuǎn)基因效率.通過自由寡肽的阻斷來比較偶聯(lián)寡肽的新型載體與未偶聯(lián)寡肽載體的轉(zhuǎn)染效率.體內(nèi)試驗使用SKOV-3c

12、細(xì)胞接種裸鼠成瘤,然后使用偶聯(lián)寡肽的新型載體攜帶α-干擾素的真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行瘤內(nèi)注射,觀察腫瘤生長情況及裸鼠的生存期. 結(jié)論:新型載體易于偶聯(lián)新的功能性的基團(tuán),新構(gòu)建的載體通過與靶向寡肽MARAKE偶聯(lián)后,可以提高對Her-2陽性腫瘤細(xì)胞基因效率.偶聯(lián)寡肽的載體具備了對Her-2陽性腫瘤細(xì)胞的靶向性.新型非病毒載體攜帶α-干擾素質(zhì)粒治療荷瘤裸鼠效果結(jié)果顯示了偶聯(lián)寡肽的新型載體具有較好的體內(nèi)應(yīng)用前景.結(jié)論與展望:本研究選擇多羥

13、基的環(huán)糊精衍生物作為骨架,通過CDI這個試劑,與低分子量PEI進(jìn)行偶聯(lián)形成新的共聚物.CDI是可以將具有羥基的化合物和具有氨基的化合物進(jìn)行連接的試劑,并且連接在兩個化合物之間的酯鍵可以降解.在合成的共聚物中篩選到了有較強(qiáng)縮合DNA的能力的,轉(zhuǎn)基因效率較高的新型轉(zhuǎn)基因載體. 通過比較共聚物的不同組成和轉(zhuǎn)基因效率的關(guān)系,認(rèn)為PEI的接入量與共聚物縮合DNA的能力和轉(zhuǎn)基因的效率有直接的關(guān)系.新的共聚物中PEI的接入量高,共聚物縮合DN