含肝靶向糖基配體的兩親性殼聚糖的制備、表征和在肝癌治療中的應(yīng)用.pdf

1、原發(fā)性肝癌作為全球范圍內(nèi)的高發(fā)疾病,是目前病死率最高的幾種惡性腫瘤之一。關(guān)于肝癌的治療,最為有效的方法即為肝癌根治切除術(shù),但不幸的是僅有20％的肝癌患者具備接受該類手術(shù)。約80%的患者因癌細胞迅速擴散或肝功能損傷嚴重而喪失接受根治術(shù)的機會,致死率較高。此外,權(quán)威數(shù)據(jù)顯示世界范圍內(nèi)的肝癌患者整體的5年生存率僅為5%左右,尋求更加高效安全的肝癌治療手段已迫在眉睫。肝癌在病理特點方面主要表現(xiàn)為發(fā)病隱匿、惡化速度迅猛、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率高等,給臨床的

2、治療帶來了諸多困難。近年來的肝動脈栓塞化療雖然可有效降低肝癌患者的復(fù)發(fā)率和5年死亡率,但由于經(jīng)濟費用高昂且細胞靶向性不理想,依然無法滿足肝癌的臨床治療需求。
　　納米技術(shù)作為上世紀80年代新型的前沿技術(shù),在多個學科領(lǐng)域中均得到了較為長足的發(fā)展,關(guān)于智能特性的納米材料的研究也在不斷深入。納米藥劑學作為納米材料的一個分支,目前在藥劑學領(lǐng)域的發(fā)展較為迅速,主要涉及納米載體藥物、納米級活性成分研究等方面,使靶向定位治療和長效緩釋治療成為了

3、可能。納米載體藥物主要包括納米脂質(zhì)體、納米聚合膠束、納米微球等,不僅能實現(xiàn)BCSI類藥物的緩釋釋放和靶向定位釋放,而且可以有效改善BCSII類藥物的水溶性。肝臟作為人體的重要代謝器官,功能一旦發(fā)生大幅減弱,重則可危及患者生命,肝癌治療過程中盡量降低對正常肝細胞的損傷是肝癌化療過程中所需考慮的重要因素?；诖?靶向治療對于肝癌患者至關(guān)重要,不僅能夠提高抗肝癌藥物在腫瘤部位的藥物濃度而且可以降低化療藥物的毒副作用,可最大限度地降低對腫瘤周圍

4、正常肝細胞和其它器官的影響。國內(nèi)外臨床研究證實,在肝實質(zhì)和肝細胞表面均存在一些特異性受體如:半乳糖受體、甘露糖受體以及去唾液酸糖蛋白受體等,這些受體的存在為肝靶向藥物提供了天然的作用靶點。殼聚糖、海藻多糖、半乳糖等高分子材料因具有生物相容性好、可降解等優(yōu)點,目前被廣泛用于修飾性載藥的納米靶向制劑的制備,且能夠與肝臟細胞上的受體進行特異性結(jié)合,進而實現(xiàn)對肝癌的靶向治療。此外,人體肝臟血流豐富且對入血藥物吸收速度較快,對于無法通過受體結(jié)合的

5、靶向制劑而言,適宜的粒徑依然能夠順利經(jīng)肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(Reticuloendothelial system,RES)和單核吞噬系統(tǒng)(Mononuclear phagocytic system,MPS)而富集于肝臟實現(xiàn)靶向定位治療。
　　在靶向制劑的研究領(lǐng)域中,半乳糖和殼聚糖一直被作為常用的高分子材料,且能滿足肝臟表明特異性受體結(jié)合的需求,經(jīng)特異性高分子基團修飾的納米系統(tǒng)均能夠順利實現(xiàn)肝靶向。因此,在本次研究中,以將十四酸(Myr

6、istic acid,MA)作為疏水組分接枝到親水的O-羧甲基殼聚糖(O-Carboxymethyl Chitosan,CC)上,通過上述聚合物在水中的自我組裝,制備了具有兩親性的殼聚糖衍生物納米粒。并分別使用含半乳糖殘基的乳糖酸和含甘露糖殘基的海藻多糖對其進一步修飾,最終制得乳糖-十四酰-羧甲基殼聚糖(Lactose-tetradecanoyloxy-carboxymethyl chitosan,LMCC)、海藻多糖-海藻多糖-十四酰

7、-羧甲基殼聚糖(Algal polysaccharide-tetradecanoyloxy-carboxymethyl chitosan,AMCC)這兩種具有肝靶向性的納米給藥載體。采用傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜(Fourier transform infrared,FTIR)、核磁共振(1H NMR)、X射線衍射、熱重分析法(Thermal gravimetric analysis,TGA)等分析方法表征LMCC與AMCC的化學組成、晶型及熱

8、穩(wěn)定性。并以阿霉素為模型藥物,對所制備的兩種肝靶向納米給藥系統(tǒng)的肝靶向活性和釋藥性能進行了研究,通過深入的研究對上述兩種納米給藥體系的性能進行了全面評價。
　　第一章含肝靶向糖基配體的兩親性殼聚糖的制備與表征
　　以殼聚糖為載體材料,將其與以酰氯法活化十四酸的羧基進行縮合,制備出納米級的十四酰-羧甲基殼聚糖(MCC)。為使所制備的殼聚糖納米粒具有更好的靶向性,分別使用含半乳糖殘基的乳糖酸和含甘露糖殘基的海藻多糖進行修飾,制備

9、出具有更好肝癌細胞靶向性的納米級乳糖-十四酰-羧甲基殼聚糖(LMCC)與海藻多糖-十四酰-羧甲基殼聚糖(AMCC),隨后對其進行定性分析。FTIR和1HNMR對所制備納米粒進行的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果顯示,所制備的納米粒為均為目標物。其中1HNMR結(jié)果計算得LMCC中,十四酸的DS為63,乳糖殘基的DS為44;AMCC中,十四酸的DS為54,海藻多糖殘基的DS為43。X射線衍射結(jié)果表明LMCC與AMCC由羧甲基殼聚糖的晶型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形結(jié)構(gòu),說

10、明經(jīng)修飾后納米粒的水溶性將進一步增加,且能夠滿足靶向釋藥的需求。TGA結(jié)果表明,由于聚合反應(yīng)的存在,LMCC和AMCC的熱力學性質(zhì)均與CC有很大差異,表明經(jīng)過聚合枝接反應(yīng)后,殼聚糖的原有熱力學性能已被改變,其原有的結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變。
　　第二章含肝靶向糖配體的兩親性殼聚糖納米粒的性質(zhì)和藥劑學性能研究
　　本章以阿霉素(Adriamycin,ADM)為模型藥物,對所制備的LMCC與AMCC納米粒的增溶效果和藥劑學性能進行研究。

11、LMCC與AMCC分子由于含有疏水性羧化殼聚糖鏈、親水性羧基以及糖配體而具有兩親性,殼聚糖分子分子間和分子內(nèi)的氫鍵被破壞后,由于結(jié)構(gòu)剛性的改變使其能在水中自發(fā)組裝成納米粒子。制備LMCC與AMCC納米粒,以透射電子顯微鏡(TEM)考察納米粒的形態(tài),所制備的納米粒的粒徑和Zeta電位使用動態(tài)激光光散射法(DLLS)進行測定。制備載ADM的LMCC與AMCC納米粒,考察其包封率、載藥量和體外釋放行為。
　　采用透析法制備空白和載ADM

12、的LMCC與AMCC納米粒,TEM觀察形態(tài)為較圓整的球形,平均粒徑為20~30nm。DLLS法測定LMCC納米粒與AMCC納米粒的水化平均粒徑分別為67.5±11.1nm,80.4±13.1nm;LMCC納米粒與AMCC納米粒在純水中的Zeta電位分別為-17.5±3.7mV,-18.7±5.4mV。包載ADM后,LMCC納米粒與AMCC納米粒的粒徑有所增大,分別達到86.8±10.3nm,102.5±18.9nm;Zeta電勢均無明顯

13、變化。載ADM的LMCC納米粒與AMCC納米粒的包封率分別達到81.6%±1.2%,70.3%±0.6%;載藥量分別為3.8%±0.3%,3.4%±0.2%;可有效地將ADM載入納米粒內(nèi)核,增加其水中溶解度。載ADM的LMCC納米粒與AMCC納米粒均表現(xiàn)出pH敏感性,在pH5.5釋放介質(zhì)中的釋放速率明顯大于pH7.4釋放介質(zhì)。LMCC納米粒與AMCC納米粒均呈現(xiàn)先突釋后緩釋的釋放特征,在0~4h釋放較快,累積可達50%~60%,在4~2

14、4h釋放較慢,累積達70%~96%。同等條件下,LMCC納米粒的釋放速度略快于AMCC納米粒。
　　第三章載阿霉素的肝靶向兩親性殼聚糖納米粒的抗腫瘤作用、靶向性與安全性
　　以異硫氰酸羅丹明B(Rhodamine B Isothiocyanate,RITC)標記LMCC納米粒(RITC-LMCC)與AMCC納米粒(RITC-AMCC),考察納米粒在Huh人肝癌細胞中的攝取。以H22移植瘤小鼠為模型,考察載ADM的LMCC納米

15、粒、AMCC納米粒的體內(nèi)抑瘤效果和組織分布。溶血試驗和急性毒性試驗考察LMCC與AMCC納米粒的安全性。
　　以肝癌細胞和HT22海馬神經(jīng)細胞為受試對象,載阿霉素的LMCC納米粒與AMCC納米粒對受試細胞進行的轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染1h、2h、4h時兩組納米粒在肝癌細胞中的熒光強度均高于HT22海馬神經(jīng)細胞。該結(jié)果表明,LMCC和AMCC對肝癌細胞具有較好的選擇性,能夠?qū)崿F(xiàn)對肝癌的靶向治療。使用高中低三種劑量(濃度為2mg/mL,劑量

16、為75μL、150μL、300μL)的載阿霉素納米粒對肝癌細胞進行轉(zhuǎn)染,結(jié)果顯示肝癌細胞攝入的納米粒的量隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加而增加,說明該類納米粒被肝癌細胞攝入的量呈濃度依賴型。
　　在納米粒攝取時間的評價結(jié)果顯示,納米粒對細胞轉(zhuǎn)染1h時,細胞內(nèi)的納米粒攝入量較小,但在轉(zhuǎn)染2h時,納米粒的熒光強度增加較為明顯,在4h時則增至最大。該結(jié)果表明,納米粒的攝取量也呈時間依賴型,制備成緩釋的納米制劑更有利于納米粒進入作用的靶器官。
　

17、　以H22移植瘤小鼠模型考察了載ADM的LMCC納米粒與載ADM的AMCC納米粒的抑瘤效果。結(jié)果顯示LMCC納米粒組的抑瘤率為62.7%±5.4%,顯著高于鹽酸阿霉素溶液組的51.2%±7.7%,具有較好的抑瘤效果;AMCC納米粒組的抑瘤率為42.5%±14.7%,與鹽酸阿霉素溶液組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。表明通過乳糖修飾的LMCC和AMCC納米?？稍鰪妼Ω文[瘤細胞的靶向性,LMCC納米粒的抑瘤效果較好,AMCC的則稍差一些。

18、
　　H22荷瘤小鼠的組織分布顯示:相比于鹽酸阿霉素溶液,乳糖修飾的LMCC納米粒對肝腫瘤和肝臟均有良好的靶向性,海藻多糖修飾的AMCC納米粒對肝臟具有不錯的靶向性,對H22肝腫瘤未體現(xiàn)出靶向性;LMCC納米粒和AMCC納米粒在肺和脾中的ADM濃度也高于鹽酸阿霉素溶液;LMCC納米粒和AMCC納米粒均可降低ADM對心和腎的毒性。
　　最高濃度10mgL·mL-1的LMCC納米粒和AMCC納米粒的溶血率低于5%;小鼠分別給予2