同時檢測三種蟲媒病毒的一步三重RT-PCR酶聯(lián)雜交方法建立.pdf

1、蟲媒病毒屬于一組由媒介昆蟲攜帶，通過敏感脊椎動物被叮咬從而得到傳播的病毒。蟲媒病毒可以引發(fā)多種人畜共患病，給我國公共衛(wèi)生和家畜養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重威脅和經(jīng)濟損失。人感染蟲媒病毒后會表現(xiàn)出多種臨床癥狀，其中以出疹和發(fā)熱最常見，病情嚴重者還會產(chǎn)生如腦炎、腦膜炎等癥狀危及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，甚至死亡。目前，尚沒有特效藥物治療蟲媒病毒病，主要以注射疫苗來對蟲媒病毒病進行預(yù)防。因此，盡量避免蟲媒病毒的爆發(fā)和流行并加強對蟲媒病毒進行檢測顯得的十分重要。目前，在

2、我國對大多數(shù)蟲媒病毒的檢測，仍然通過傳統(tǒng)血清學(xué)抗體檢測和細胞培養(yǎng)分離病毒來進行診斷。盡管這些方法被譽為“金標(biāo)準”，可以對蟲媒病毒進行確診，但敏感性較低，操作周期較長如細胞培養(yǎng)需要一周左右的時間，并且標(biāo)本消耗較大，難以適應(yīng)臨床和現(xiàn)場診斷的要求。
　　本實驗構(gòu)建了多重RT-PCR聯(lián)合酶聯(lián)雜交技術(shù)，應(yīng)用該技術(shù)可以通過一次擴增同時完成對三種蟲媒病毒（乙腦病毒，蓋塔病毒和塔希那病毒）的檢測。它的主要內(nèi)容為，首先比對 Genbank發(fā)表的和本

3、實驗室測定的已知三種病毒基因序列，在序列高度保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并合成含有5＇端生物素的引物和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的種特異性探針。然后，采用One-Step RT-PCR Kit（QIAGEN）進行一步法RT-PCR,通過種特異性探針識別病原PCR產(chǎn)物，加入HRP底物，通過顯色鑒定病原。本研究建立的多重 RT-PCR酶聯(lián)雜交方法檢測敏感性為JEV:1PFU/mL，GETV:10PFU/mL，TAHV:10PFU/mL。將此方法應(yīng)用于檢測