苯丙酸諾龍干預燙傷大鼠雄激素受體介導靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的實驗研究.pdf

1、研究目的：探討苯丙酸諾龍對雄激素受體介導靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，進一步了解蛋白同化激素治療燙傷的作用機制，為蛋白同化激素的臨床應用與推廣提供理論依據(jù)。 研究方法：采用隨機對照實驗，苯丙酸諾龍作為干預措施，對20％TBSA深Ⅱ°燙傷大鼠模型以及經(jīng)RNA干擾后的培養(yǎng)大鼠肝細胞進行處理，從體內(nèi)和體外兩個方面，觀測苯丙酸諾龍對大鼠不同組織細胞類固醇受體輔助活化因子1(SteroidReceptorCoactivator,SRC-1)及下游

2、c-myc、IGF-1基因表達水平的影響。 1、體內(nèi)實驗：Wistar大鼠36只，采用隨機數(shù)字表法，隨機分為實驗組、對照組與空白組，各12只，實驗組與對照組制備成20％TBSA深Ⅱ°燙傷大鼠模型，實驗組肌注苯丙酸諾龍5mg/kg，對照組用生理鹽水代替，空白組不做任何處理。通過Genebank設計合成SRC-1、c-myc、IGF-1基因PCR引物上游F、引物下游R與TaqMan熒光探針。燙傷后21天全部大鼠斷頭處死，剪取肝臟、雙

3、側(cè)睪丸、雙側(cè)卵巢組織約90mg±10mg，TrizolTM法提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量PCR擴增，檢測肝臟、睪丸、卵巢組織SRC-1、c-myc、IGF-1基因的表達水平。 2、體外實驗：通過Genebank設計合成大鼠肝細胞SRC-1的小干涉RNA片段(smallinterferingRNA，siRNA)共4對。采用重組DNA技術，雙酶切質(zhì)粒pSUPEREGFP1，將siRNA雙鏈連接導入質(zhì)粒pSUPEREGFP1，

4、構(gòu)建siRNA表達質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)菌落PCR、雙酶切驗證、DNA測序篩選出陽性克隆，提取回收純化陽性siRNA表達質(zhì)粒載體。大鼠肝細胞株傳代培養(yǎng)，將肝細胞按4對siRNA、脂質(zhì)體、空白隨機對照設計復孔種板，采用脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染肝細胞，進行RNA干擾(RNAi)，轉(zhuǎn)染后12、24小時收集肝細胞，經(jīng)熒光定量PCR從4對siRNA篩選出最佳RNA干擾效果的siRNA序列。再將培養(yǎng)大鼠肝細胞分為實驗組(+NP+RNAi)、對照組

5、(-NP+RNAi)、實驗空白組(+NP-RNAi)、對照空白組(-NP-RNAi)共4組復6孔種板，使用篩選出的最佳siRNA質(zhì)粒載體同樣方法轉(zhuǎn)染肝細胞，轉(zhuǎn)染干擾后4小時按10μg/ml苯丙酸諾龍?zhí)幚砀渭毎?，轉(zhuǎn)染后24小時收集裂解肝細胞，以此為模板，逆轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量PCR擴增，檢測肝細胞SRC-1、c-myc、IGF-1基因的表達水平。 研究結(jié)果：1、體內(nèi)實驗結(jié)果表明，苯丙酸諾龍治療20％TBSA深Ⅱ°燙傷大鼠模型前后，大

6、鼠性腺(睪丸、卵巢)實驗組與對照組SRC-1基因表達水平不同，肝臟、睪丸、卵巢組織實驗組與對照組IGF-1基因的表達水平不同，兩者P＜0.05，有統(tǒng)計學意義，提示苯丙酸諾龍能提高性腺SRC-1和肝臟、睪丸、卵巢IGF-1基因表達；而肝臟SRC-1基因，肝臟、睪丸、卵巢c-myc基因表達水平實驗組與對照組組間差異不明顯，P＞0.05，沒有統(tǒng)計學意義，提示苯丙酸諾龍不能提高肝臟SRC-1和肝臟、睪丸、卵巢c-myc基因表達；實驗組SRC-1

7、基因表達水平與空白組肝臟、睪丸、卵巢三種不同組織SRC-1基因表達豐度之間存在相關關系，相關系數(shù)r=0.953，t檢驗P＜0.05，有統(tǒng)計學意義。 2、體外實驗結(jié)果表明，RNA干擾與苯丙酸諾龍干預后，實驗組與實驗空白組，對照組與對照空白兩組比較，肝細胞SRC-1、IGF-1、c-myc基因表達水平均明顯降低，P＜0.05，有統(tǒng)計學意義，提示RNA干擾SRC-1效果優(yōu)良，SRC-1表達抑制后IGF-1、c-myc表達也被抑制而下降

8、；實驗組與對照組，實驗空白組與對照空白組，大鼠肝細胞SRC-1、IGF-1、c-myc基因的表達水平相似，P＞0.05，沒有統(tǒng)計學意義，提示苯丙酸諾龍在體外不能誘導提高SRC-1、IGF-1、c-myc基因表達，也不能逆轉(zhuǎn)RNA干擾SRC-1后SRC-1、IGF-1、c-myc基因表達的下降。 研究結(jié)論：1.苯丙酸諾龍對性腺(睪丸和卵巢)通過細胞核內(nèi)雄激素受體發(fā)揮作用需要SRC-1基因的正常表達，SRC-1的正常表達是IGF-1