CDK11相關(guān)蛋白及cyclin D3-CDK11調(diào)控雄激素受體轉(zhuǎn)錄活性的研究.pdf

1、細(xì)胞周期素依賴的激酶11(p58)(CDKllp58，p58PITSLRE，p58GTA，p58elk-1)是最早被發(fā)現(xiàn)的CDKll家族蛋白，在B．1，4．半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1分離純化過程中得到，能與B-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1相互作用，并磷酸化β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶l，對(duì)其活性起增強(qiáng)作用。CDKllp58在細(xì)胞內(nèi)特異性地表達(dá)于G2／M期，并且過表達(dá)CDKllp58能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)發(fā)生變化，有絲分裂障礙，阻滯在G2fM期。CDK

2、llp58具有促凋亡作用，且該作用與其激酶活性密切相關(guān)。雖然CDKllp58在細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮著負(fù)調(diào)控子的重要作用，但是它的上游調(diào)控因子和下游的效應(yīng)分子還沒有被發(fā)現(xiàn)。 最近的研究發(fā)現(xiàn)CDKll家族另一主要成員CDKllPll0參與了RNAPII轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成，并與RNA剪切拼接因子RNPSl、cyclinL等相關(guān)，因此推測(cè)CDKll信號(hào)途徑與轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后加工有關(guān)。我們以全長(zhǎng)的CDKllp58為誘餌蛋白，利用LexA酵母雙雜交系

3、統(tǒng)，在人胎肝cDNA文庫中篩選其相互作用蛋白，并發(fā)現(xiàn)一個(gè)MYST家族組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶HB01(HistoneacetyltransferasebindingtoORCl)的羧基端(330～6n位氨基酸)能與CDKllp58在酵母內(nèi)發(fā)生相互作用。接著我們利用GST-pulldown和免疫共沉淀的方法，證明了全長(zhǎng)的HB01蛋白與CDKllp58在體外的直接結(jié)合和在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。由于CDKllp58特異表達(dá)在G2／M期，因此內(nèi)源性CDKl

4、lpSs與HB01的生理性相互作用也僅可在細(xì)胞周期的G2／M期檢測(cè)到。利用免疫熒光結(jié)合激光共聚焦我們發(fā)現(xiàn)該兩者的相互作用發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)。HB01是在1999年新被克隆的具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)活性的蛋白分子，與轉(zhuǎn)錄、復(fù)制均有密切關(guān)系。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在體外HAT檢測(cè)反應(yīng)體系中直接加入原核表達(dá)的CDKllp58純化蛋白，能顯著促進(jìn)HB01對(duì)的HAT活性；在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)CDKllp58后，內(nèi)源性HB01的HAT活性也有增強(qiáng)；作為對(duì)照

5、，另一個(gè)著名的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300的HAT活性在體外及細(xì)胞內(nèi)均不受CDKllp58的影響。這些結(jié)果提示CDKllp58可能通過對(duì)HB01的HAT活性的調(diào)控，參與特定靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而發(fā)揮其阻遏細(xì)胞周期及促凋亡的功能。 由于HB01已證明是雄激素受體(AR)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄共抑制子，而我們實(shí)驗(yàn)室也報(bào)道了細(xì)胞周期素D3(eyelinD3)能與甾體類激素受體——維生素D受體(VDR)、以及激活轉(zhuǎn)錄因子(ATF5)結(jié)合，并調(diào)節(jié)這兩者

6、的轉(zhuǎn)錄活性。CyclinD3的同源蛋白cyclinD1對(duì)AR的抑制性調(diào)控已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道。結(jié)合上述情況，我們猜測(cè)作為HB01和cyclinD3的相關(guān)分子，CDKllp58可能參與了真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。我們從AR著手，發(fā)現(xiàn)CDKllp58能與AR在體外和細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用，并且這種作用并不依賴于AR共抑制子HB01的介導(dǎo)。AR在結(jié)構(gòu)上可分為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(TAD)、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)、鉸鏈區(qū)和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)幾個(gè)功能相對(duì)獨(dú)

7、立的區(qū)域。CDKllp58蛋白則有一個(gè)位于中間的絲／蘇氨酸激酶活性結(jié)構(gòu)域和功能尚不明確的氨基端、羧基端。我們根據(jù)這兩個(gè)蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了一系列片段突變體，通過體內(nèi)、體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)了介導(dǎo)AR與CDKllp58相互作用的結(jié)構(gòu)域分別為AR轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域氨基端的轉(zhuǎn)錄激活單元1(TAUl)和CDKllp58的絲／蘇氨酸激酶活性結(jié)構(gòu)域。 雄激素和AR組成的信號(hào)通路對(duì)于男性個(gè)體生殖系統(tǒng)及其它組織器官的發(fā)育、分化，以及男性腫瘤如前列腺

8、癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。作為核受體家族的成員之一，AR在結(jié)合了雄激素后，轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的活性。利用AR的報(bào)道基因MMTV-LUC，我們發(fā)現(xiàn)AR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄能被CDKllp58顯著抑制，并有劑量．效應(yīng)關(guān)系，這種效應(yīng)并不因內(nèi)源性HB01受RNAi抑制表達(dá)而喪失。CDKll158對(duì)AR的調(diào)控是特異性的，因?yàn)槠鋵?duì)CMV的轉(zhuǎn)錄并無影響，而對(duì)AR其它靶基因如PSA-LUC、ARE-LUC均有轉(zhuǎn)錄抑制作用。有趣的是，雖然C

9、DKll家族兩個(gè)主要成員CDKllp58與CDKllpllo由同一mRNA編碼，CDKllpllO除具有羧基端與CDKllp58完全一致的蛋白序列外，還有一段獨(dú)有的氨基端，但這兩個(gè)蛋白在功能上卻截然不同。和CDKllp58對(duì)AR的抑制作用相反的是，CDKllpllO能顯著促進(jìn)AR介導(dǎo)的靶基因轉(zhuǎn)錄。但在細(xì)胞內(nèi)并不能檢測(cè)到CDKllpllO與AR的直接相互作用。 為了驗(yàn)證CDKllp58對(duì)AR的調(diào)控是否依賴其激酶活性，我們構(gòu)建了C

10、DKllp58的激酶活性缺失型點(diǎn)突變體D224N。D224N喪失了與AR在體內(nèi)體外相互作用的能力，卻，能顯著促進(jìn)AR的轉(zhuǎn)錄活性。過表達(dá)cyclinD3能促進(jìn)CDKllpss的激酶活性，并與CDKllpss協(xié)同抑制AR；利用RNAi抑制cyclinD3的內(nèi)源性表達(dá)后，導(dǎo)致CDKllp58激酶活性和對(duì)AR調(diào)控作用的喪失。CyclinD3也能與AR在體內(nèi)外相互結(jié)合，并可能和CDKllp58一起與AR形成三元復(fù)合物。為了研究AR受CDKllp5

11、8調(diào)控的機(jī)制，我們從以下幾個(gè)方面考慮：1)AR的表達(dá)；2)AR的核定位；3)AR與共激活子／共抑制子的結(jié)合；4)AR與反應(yīng)元件的結(jié)合；5)AR內(nèi)部N／羧基端功能結(jié)構(gòu)域之間的相互作用；6)AR受cyclinD3／CDKllpss的磷酸化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AR的表達(dá)、核定位、AR與共激活子p300或共抑制子HDACl的相互作用、以及AR分子內(nèi)部N／羧基端結(jié)構(gòu)域相互作用均沒有改變，而AR與其反應(yīng)元件的結(jié)合受CDKllpss的抑制。體外激酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)

12、AR的TAD能被CDKllp58磷酸化。CDKllp58也能在細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)AR的磷酸化。利用RNAi抑制內(nèi)源性cyclinD3表達(dá)后，CDKllp58便不能增強(qiáng)AR的磷酸化水平。雄激素／AR信號(hào)途徑也與前列腺癌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)cyclinD3／CDKllp58能通過抑制AR的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡。而激酶活性缺失型CDKllpSS能對(duì)細(xì)胞的凋亡起保護(hù)作用。 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)cyclinD3／CDKllpp